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lywac

铜虫 (小有名气)

[求助] western blot中蛋白质转印问题

请教各位虫友,在western blotting中蛋白转印后,mark不清楚,是什么原因?另外,请教各位,你们做的时候,电流、电压分别多大?给个参考,先行谢过啦
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等你,是我一生的承诺
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neon_alone

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): good 2011-12-29 17:44:08
marker不清楚,你确定在转膜缓冲液加甲醇了吗?膜之前也要拿甲醇活化5-10秒钟
2楼2011-12-29 14:15:28
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necilyx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 鼓励应助! 2011-12-30 09:24:14
在转膜过程中,110mA恒流,90min,是不是转膜时间不够啊?一般来说小分子蛋白20kd一下转膜45min就可以,分子量大一些的90min就可以了。另外,转膜时,胶和膜贴在一起后尽量别在移动,不然条带不清楚,影响结果。
聪明才智要为意外做准备~~
3楼2011-12-29 15:13:18
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ljw796

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+1): 鼓励交流! 2011-12-30 09:24:21
能否说下你的实验步骤,以便于大家分析?
4楼2011-12-29 16:13:39
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lywac

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by neon_alone at 2011-12-29 14:15:28:
marker不清楚,你确定在转膜缓冲液加甲醇了吗?膜之前也要拿甲醇活化5-10秒钟

这些都做过了
等你,是我一生的承诺
5楼2011-12-29 22:21:09
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lywac

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by necilyx at 2011-12-29 15:13:18:
在转膜过程中,110mA恒流,90min,是不是转膜时间不够啊?一般来说小分子蛋白20kd一下转膜45min就可以,分子量大一些的90min就可以了。另外,转膜时,胶和膜贴在一起后尽量别在移动,不然条带不清楚,影响结果。

我怕是转膜转过了
等你,是我一生的承诺
6楼2011-12-29 22:21:55
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will5252

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lywac(金币+5): 有帮助 谢谢回帖,我用的是湿转,有可能是膜没有压紧 2011-12-30 12:42:21
转膜一般80V恒压2.5小时或者100v恒压1.5小时,一般80V的时候电流在200多一点,100V的时候电流在将近300。你的mark不清楚可能是因为胶和膜没有压紧,也有可能转膜电压和时间有问题。(我说的是湿转,不知道楼主用的半干转还是湿转)
7楼2011-12-30 09:46:08
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ypmaok

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
lywac(金币+5): 2011-12-30 12:52:28
现在一般都是用PVDF膜,一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时,有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色,看一下在凝胶中Marker是否清晰,作为转膜前的参照。看你的情况,很可能你的原因是膜没有压紧,或者是转膜不充分,电流或电压过小或转膜时间不够。
8楼2011-12-30 10:53:05
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lywac

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
: Originally posted by ypmaok at 2011-12-30 10:53:05:
现在一般都是用PVDF膜,一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时,有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色,看一下在凝胶中Marker是否清晰,作为转膜前的参照。看你的情况,很可 ...

我加了两块膜放在一侧一起转了一下,发现第二块膜上面也有mark,染色后也有条带,用的是80mA恒流转1.5小时。
等你,是我一生的承诺
9楼2011-12-30 12:45:37
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lywac

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ypmaok at 2011-12-30 10:53:05:
现在一般都是用PVDF膜,一般不存在转不转过的问题。比如我们现在湿转一般是100V恒压1.5小时,有时候也会2小时。可以在转之前用丽春红适当染色,看一下在凝胶中Marker是否清晰,作为转膜前的参照。看你的情况,很可 ...

我用两块膜在一侧一起转试了一下,转完后发现第二块膜上面也有较为清晰的mark,染色后有大分子的条带,用的是80mA恒流1.5小时,凝胶上面的mark确实不太清晰
等你,是我一生的承诺
10楼2011-12-30 12:51:33
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