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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 有关western blot 的问题
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searush

铜虫 (初入文坛)

[求助] 有关western blot 的问题 已有2人参与

请问下  我做的是NF-KB p65的抗体  显影结果怎么会在目的带中出现两条带呢？求解

有关western blot  的问题
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学术研究
1楼 2015-01-12 17:06:47
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searush

铜虫 (初入文坛)
自己顶一个  希望 大虫们指教
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学术研究
2楼2015-01-12 17:09:35
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molizerd

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
searush(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:04:55
这是压片曝光的还是显色的还是机器曝光的？
如果是压片的话是因为你压的胶片动了。其他的你这个是单抗还是多抗？

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3楼2015-01-12 17:33:29
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
searush(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:05:07
除了楼上说的原因之外，还有就是你在进行PAGE的时候，是一次上样还是两次上样呢，如果是两次上样的话，也会产生这种结果的。整个实验是没什么问题的。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
4楼2015-01-12 17:37:32
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by molizerd at 2015-01-12 17:33:29
这是压片曝光的还是显色的还是机器曝光的？
如果是压片的话是因为你压的胶片动了。其他的你这个是单抗还是多抗？

机器曝光的
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学术研究
5楼2015-01-13 18:21:15
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-01-12 17:37:32
除了楼上说的原因之外，还有就是你在进行PAGE的时候，是一次上样还是两次上样呢，如果是两次上样的话，也会产生这种结果的。整个实验是没什么问题的。

我就上样一次而已
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学术研究
6楼2015-01-13 18:21:50
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searush

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by molizerd at 2015-01-12 17:33:29
这是压片曝光的还是显色的还是机器曝光的？
如果是压片的话是因为你压的胶片动了。其他的你这个是单抗还是多抗？

单抗  CST的抗体
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学术研究
7楼2015-01-13 18:22:29
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molizerd

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by searush at 2015-01-13 18:22:29
单抗  CST的抗体...

今天我师弟也曝成这样了。。他上样是纯化的原核表达蛋白。。抗体是他自己制备的单抗。。老师说可能是蛋白降解了。。或者你的蛋白样品是不是自己就能形成聚合体，然后成了不同大小的条带。

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8楼2015-01-13 23:58:19
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

★ ★
searush(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-01-14 20:05:22
引用回帖:
6楼: Originally posted by searush at 2015-01-13 18:21:50
我就上样一次而已...

据我做WB的经验，你这个结果还是没什么本质问题的。我认为可能还是实验过程中操作误差带来的（例如：转膜的时候膜不小心动了一下）。仔细观察两条带的话，不难发现，上下的两条带虽然不在同一个位置，但是应该是一个蛋白的。
机器曝光，采用单抗（GST的抗体或是HIS抗体），这些都是再正常不过了，况且western这个实验本身是没有太大技术含量的，呵呵，只要做的过程中操作上不出现大披露，试剂使用正确，样品确保正常，就应该会成功。
希望对你有所帮助。
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
9楼2015-01-14 09:31:22
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by searush at 2015-01-13 18:21:50
我就上样一次而已...

还有一个很好办的方法，你观察你的marker，如果marker也是和蛋白的条带一样，都出现双条带的话，就说明了不是样品的问题，而是操作过程中出现的误差。
如果marker是正常的，只有蛋白出现了双条带，那就是样品的问题了。

所以你先确定marker是否正常，谢谢
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
10楼2015-01-14 09:34:36
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