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有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？ 已有1人参与
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| 我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数，需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做，建议用探针法做。现在毫无头绪，不知道怎么设计，怎么合成？望各位高人指点一下…… |
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sandisk411
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
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TaqMAN法和SYB法都可以用于检测拷贝数，关键是你能不能设计出合适的探针。用RT-PCR法鉴定拷贝数需要你对材料非常了解，比如是转基因T0代，如果是单拷贝的，插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1:2；双拷贝的，就该是1:1；如果T1代，RT-PCR用于单株分析时，情况会很复杂，可以说你将无法准确判断，除非你已知是纯合的单株。 对于遗传背景不清楚的，你最好用SOURTHERN杂交确认，这是最可靠和简单的方法了。 要不，你可以尝试，把插入片段的左、右两边的序列给克隆测序。 |
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flytime111516楼2011-12-24 12:11:26
2楼2011-12-22 16:45:28
shaquila
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shaquila
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austin2008
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7楼2011-12-23 09:01:32
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8楼2011-12-23 09:03:35
austin2008
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【答案】应助回帖
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| 我做过检测重组毕赤酵母中外源基因拷贝数的实验，用的就是探针法，内参用的是GAPDH，检测的准确度和重复性还是很好的！引物和探针你自己不要设计，交给专业的设计公司设计和合成，也不是很贵，国内的公司一套探针引物（包括上下游引物，探针）也就1200+吧，国外的ABI等公司合成一般要贵一倍左右，一般可以做1500-2000个样品。SYBY法不是很准确，精确定量最好还是用探针法，我的实验用的样品的基因组DNA和你的不大一样，不过原理差不多的。 |
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9楼2011-12-23 09:16:52
shaquila
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wanhscn(金币+2): good 2011-12-24 17:10:10
wanhscn(金币+2): good 2011-12-24 17:10:10
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还好吧，转基因能插入多少多少拷贝呢，至少在植物转化中，几乎所有文献都是用southern杂交检测，有尝试过用荧光定量，但是效果显然不如此法准确，至少存在争议 下面是探讨用荧光定量验证植物转基因拷贝数的文献 Two-fold differences are the detection limit for determining transgene copy numbers in plants by real-time PCR Estimating the number of integrations in transformed plants by quantitative real-time PCR |
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10楼2011-12-23 10:00:20
