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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)

[求助] 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？ 已有1人参与

我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数，需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做，建议用探针法做。现在毫无头绪，不知道怎么设计，怎么合成？望各位高人指点一下……
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1楼 2011-12-22 16:26:31
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-22 18:04:14:
楼主做的是专基因检测吗？如果是，那不建议用荧光定量，主流的方法用SOUTHERN杂交。TAQMAN可以让公司设计合成，sybr法也能做，两种方法没有质变

是做转基因检测，southern杂交在做，可是无法确定拷贝数，仅仅根据灰度值判断，觉得不太靠谱
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4楼2011-12-22 19:37:05
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by love_st at 2011-12-22 16:45:28:
设计引物探针，构建质粒，定量

探针怎么设计？我的是siRNA片段，发卡结构，应该设计在哪段？
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5楼2011-12-22 19:38:04
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by austin2008 at 2011-12-23 09:16:52:
我做过检测重组毕赤酵母中外源基因拷贝数的实验，用的就是探针法，内参用的是GAPDH，检测的准确度和重复性还是很好的！引物和探针你自己不要设计，交给专业的设计公司设计和合成，也不是很贵，国内的公司一套探针 ...

谢谢，能不能推荐一个国内的公司。我是直接把序列发给他们他们负责设计合成吗？设计探针大概需要几天能回来？
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11楼2011-12-23 12:44:53
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
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楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-23 10:00:20:
还好吧，转基因能插入多少多少拷贝呢，至少在植物转化中，几乎所有文献都是用southern杂交检测，有尝试过用荧光定量，但是效果显然不如此法准确，至少存在争议

下面是探讨用荧光定量验证植物转基因拷贝数的文 ...

谢谢，southern杂交可重复性确实不是很高。现在也在做southern。因为我杂交片段比较小，一直来讲都比较困难
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12楼2011-12-23 12:47:09
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by sandisk411 at 2011-12-24 12:11:26:
TaqMAN法和SYB法都可以用于检测拷贝数，关键是你能不能设计出合适的探针。用RT-PCR法鉴定拷贝数需要你对材料非常了解，比如是转基因T0代，如果是单拷贝的，插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1: ...

你后来建议的方法是genomic walking。可以做，我也正在尝试，可是这种方法还没有达到测出拷贝数的水平，技术有待提高。你说的遗传背景我不是很懂。希望您能再说的清楚一些，你说的单拷贝是什么意思，我不知道我的目的基因是几拷贝我才要测拷贝数呀？你说的“如果是单拷贝”指的是什么？
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18楼2011-12-24 23:35:38
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
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楼: Originally posted by sandisk411 at 2011-12-26 08:18:25:
单拷贝就是染色体上只有1处有外源基因。遗传背景这个词可能不是很好，容易让人混淆。我举个T-DNA转基因水稻吧，比如是转基因出来的当代是T0代水稻，其自交获得的下一代就是T1代，以此类推就是T2代，T3代.......。 ...

我做的是转基因动物。呵呵，现在都是0世代，谢谢你
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20楼2011-12-26 10:18:31
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