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flytime1115

铜虫 (初入文坛)

[求助] 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time?? 已有1人参与

我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数,需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做,建议用探针法做。现在毫无头绪,不知道怎么设计,怎么合成?望各位高人指点一下……
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-22 23:55:56:
判断拷贝数用单酶切来判断,用两个以上酶来单切,这个是目前公认最有效的方法

是将基因组DNA单酶切,这样准确么,如何定量还是个问题?!请贴出相关参考文献
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
7楼2011-12-23 09:01:32
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-22 18:04:14:
楼主做的是专基因检测吗?如果是,那不建议用荧光定量,主流的方法用SOUTHERN杂交。TAQMAN可以让公司设计合成,sybr法也能做,两种方法没有质变

SOUTHERN杂交的方法早就过时了吧,是很传统的方法,拷贝数较少检测尚且可以,拷贝数越多检测越不准确,重复性也不好,而且样品较多的时候费用比较高
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
8楼2011-12-23 09:03:35
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wanhscn(金币+2): 感谢参与交流 2011-12-24 17:09:48
wanhscn(金币+2): 感谢参与交流 2011-12-24 17:11:02
我做过检测重组毕赤酵母中外源基因拷贝数的实验,用的就是探针法,内参用的是GAPDH,检测的准确度和重复性还是很好的!引物和探针你自己不要设计,交给专业的设计公司设计和合成,也不是很贵,国内的公司一套探针引物(包括上下游引物,探针)也就1200+吧,国外的ABI等公司合成一般要贵一倍左右,一般可以做1500-2000个样品。SYBY法不是很准确,精确定量最好还是用探针法,我的实验用的样品的基因组DNA和你的不大一样,不过原理差不多的。

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优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
9楼2011-12-23 09:16:52
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流! 2011-12-24 15:27:53
引用回帖:
10楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-23 10:00:20:
还好吧,转基因能插入多少多少拷贝呢,至少在植物转化中,几乎所有文献都是用southern杂交检测,有尝试过用荧光定量,但是效果显然不如此法准确,至少存在争议

下面是探讨用荧光定量验证植物转基因拷贝数的文 ...

你贴出的文献分别是2002和2004年的,荧光定量PCR技术发展很快的,现在的情况与以前相比,无论是准确度、灵敏度、重复性、操作稳定性和价格方面都比southern杂交检测方法好的!当然做转基因,拷贝数可能比较低,southern杂交精确度还可以,微生物中转入基因拷贝数多的时候,这种传统的方法可能不是那么好使呢。至于你在上文中提到的“判断拷贝数用单酶切来判断,用两个以上酶来单切,这个是目前公认最有效的方法 ”,我还没听过,也没见过呢,你可以给出这种“目前公认最有效的方法”的文献吧,谢谢
优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
15楼2011-12-24 10:47:49
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