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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by austin2008 at 2011-12-23 09:16:52:
我做过检测重组毕赤酵母中外源基因拷贝数的实验，用的就是探针法，内参用的是GAPDH，检测的准确度和重复性还是很好的！引物和探针你自己不要设计，交给专业的设计公司设计和合成，也不是很贵，国内的公司一套探针 ...

谢谢，能不能推荐一个国内的公司。我是直接把序列发给他们他们负责设计合成吗？设计探针大概需要几天能回来？
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11楼2011-12-23 12:44:53
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-23 10:00:20:
还好吧，转基因能插入多少多少拷贝呢，至少在植物转化中，几乎所有文献都是用southern杂交检测，有尝试过用荧光定量，但是效果显然不如此法准确，至少存在争议

下面是探讨用荧光定量验证植物转基因拷贝数的文 ...

谢谢，southern杂交可重复性确实不是很高。现在也在做southern。因为我杂交片段比较小，一直来讲都比较困难
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12楼2011-12-23 12:47:09
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j2

木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-12-24 15:26:43
探针式要比染料靠谱点
把你的基因序列交给公司，帮你设计吧
我在宝生物设计过，还行
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
13楼2011-12-23 13:40:49
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shaquila

金虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 一般观点是southern比real-time结果更可信 2011-12-24 15:27:21
引用回帖:
12楼: Originally posted by flytime1115 at 2011-12-23 12:47:09:
谢谢，southern杂交可重复性确实不是很高。现在也在做southern。因为我杂交片段比较小，一直来讲都比较困难

楼主我觉得是你方法问题，southern杂交重复性很高的，而且经常是用多个酶单切验证将诶过，只是比较难做而已，特别对于非同位素标记的，上样量要很大
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14楼2011-12-23 14:20:56
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austin2008

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 欢迎交流！ 2011-12-24 15:27:53
引用回帖:
10楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-23 10:00:20:
还好吧，转基因能插入多少多少拷贝呢，至少在植物转化中，几乎所有文献都是用southern杂交检测，有尝试过用荧光定量，但是效果显然不如此法准确，至少存在争议

下面是探讨用荧光定量验证植物转基因拷贝数的文 ...

你贴出的文献分别是2002和2004年的，荧光定量PCR技术发展很快的，现在的情况与以前相比，无论是准确度、灵敏度、重复性、操作稳定性和价格方面都比southern杂交检测方法好的！当然做转基因，拷贝数可能比较低，southern杂交精确度还可以，微生物中转入基因拷贝数多的时候，这种传统的方法可能不是那么好使呢。至于你在上文中提到的“判断拷贝数用单酶切来判断，用两个以上酶来单切，这个是目前公认最有效的方法 ”，我还没听过，也没见过呢，你可以给出这种“目前公认最有效的方法”的文献吧，谢谢
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优秀是一种习惯;生命是一种过程;放弃是一种智慧;缺点是一种恩惠!
15楼2011-12-24 10:47:49
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sandisk411

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
TaqMAN法和SYB法都可以用于检测拷贝数，关键是你能不能设计出合适的探针。用RT-PCR法鉴定拷贝数需要你对材料非常了解，比如是转基因T0代，如果是单拷贝的，插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1:2；双拷贝的，就该是1:1；如果T1代，RT-PCR用于单株分析时，情况会很复杂，可以说你将无法准确判断，除非你已知是纯合的单株。
对于遗传背景不清楚的，你最好用SOURTHERN杂交确认，这是最可靠和简单的方法了。
要不，你可以尝试，把插入片段的左、右两边的序列给克隆测序。
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flytime1115
16楼2011-12-24 12:11:26
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 感谢分享经验 2011-12-24 17:10:51
引用回帖:
15楼: Originally posted by austin2008 at 2011-12-24 10:47:49:
你贴出的文献分别是2002和2004年的，荧光定量PCR技术发展很快的，现在的情况与以前相比，无论是准确度、灵敏度、重复性、操作稳定性和价格方面都比southern杂交检测方法好的！当然做转基因，拷贝数可能比较低，s ...

我在做realtiem pcr时候也有这个问题，即使误差控制的很小，但是也有可能出现20-30％的误差，特别是用2deltact法，多次实验结果可能不一样，对于低拷贝的材料，荧光定量是有检测下限的，不信你可以试试，如果用southern验证了单拷贝或双拷贝材料
你用realtime 作，会发现很多点在1-2这个区间上，无法分辨到底一个还是两个拷贝，因为做植物转基因考虑到后代分离的问题，所以要选单拷贝，而如你所说，微生物验证拷贝数有可能很多，比如4个拷贝和5个拷贝，即使不精细区分也许没有影响

如果你怀疑我说的，你可以去plant cell上面，看看做拟南芥和水稻的文章，找有验证拷贝数的，你会发现几乎没有用realtime的，基本都是单切southern验证～～
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17楼2011-12-24 16:39:34
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by sandisk411 at 2011-12-24 12:11:26:
TaqMAN法和SYB法都可以用于检测拷贝数，关键是你能不能设计出合适的探针。用RT-PCR法鉴定拷贝数需要你对材料非常了解，比如是转基因T0代，如果是单拷贝的，插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1: ...

你后来建议的方法是genomic walking。可以做，我也正在尝试，可是这种方法还没有达到测出拷贝数的水平，技术有待提高。你说的遗传背景我不是很懂。希望您能再说的清楚一些，你说的单拷贝是什么意思，我不知道我的目的基因是几拷贝我才要测拷贝数呀？你说的“如果是单拷贝”指的是什么？
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18楼2011-12-24 23:35:38
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sandisk411

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
单拷贝就是染色体上只有1处有外源基因。遗传背景这个词可能不是很好，容易让人混淆。我举个T-DNA转基因水稻吧，比如是转基因出来的当代是T0代水稻，其自交获得的下一代就是T1代，以此类推就是T2代，T3代.......。
在T0代时就检测拷贝数是最方便解释的，因为T-DNA框只在1条同源染色体上插入，所以插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1:2；双拷贝的，就该是1:1；
如果是T1代的苗，比值是1:1的话，可能是单拷贝插入株的纯合植株，也可能是双拷贝植株的杂合株了。
所以，你需要知道你的材料是种植第几代了，是否是所谓的纯合了。我不知道你做的是什么材料，是水稻的话，做SOURTHERN不难的。
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19楼2011-12-26 08:18:25
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by sandisk411 at 2011-12-26 08:18:25:
单拷贝就是染色体上只有1处有外源基因。遗传背景这个词可能不是很好，容易让人混淆。我举个T-DNA转基因水稻吧，比如是转基因出来的当代是T0代水稻，其自交获得的下一代就是T1代，以此类推就是T2代，T3代.......。 ...

我做的是转基因动物。呵呵，现在都是0世代，谢谢你
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20楼2011-12-26 10:18:31
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