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flytime1115

铜虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 213
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在线: 3.1小时
虫号: 1259100
注册: 2011-04-08
性别: MM
专业: 动物遗传学

[求助] 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？已有1人参与

我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数，需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做，建议用探针法做。现在毫无头绪，不知道怎么设计，怎么合成？望各位高人指点一下……

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1楼 2011-12-22 16:26:31

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

MolEPI: 5
应助: 37 (小学生)
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散金: 59
红花: 14
帖子: 553
在线: 182.3小时
虫号: 654839
注册: 2008-11-15
专业: 生物大分子结构与功能

★ ★
wanhscn(金币+2): 感谢分享经验 2011-12-24 17:10:51

引用回帖:

15楼: Originally posted by austin2008 at 2011-12-24 10:47:49:
你贴出的文献分别是2002和2004年的，荧光定量PCR技术发展很快的，现在的情况与以前相比，无论是准确度、灵敏度、重复性、操作稳定性和价格方面都比southern杂交检测方法好的！当然做转基因，拷贝数可能比较低，s ...

我在做realtiem pcr时候也有这个问题，即使误差控制的很小，但是也有可能出现20-30％的误差，特别是用2deltact法，多次实验结果可能不一样，对于低拷贝的材料，荧光定量是有检测下限的，不信你可以试试，如果用southern验证了单拷贝或双拷贝材料
你用realtime 作，会发现很多点在1-2这个区间上，无法分辨到底一个还是两个拷贝，因为做植物转基因考虑到后代分离的问题，所以要选单拷贝，而如你所说，微生物验证拷贝数有可能很多，比如4个拷贝和5个拷贝，即使不精细区分也许没有影响

如果你怀疑我说的，你可以去plant cell上面，看看做拟南芥和水稻的文章，找有验证拷贝数的，你会发现几乎没有用realtime的，基本都是单切southern验证～～