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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)

[求助] 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？ 已有1人参与

我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数，需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做，建议用探针法做。现在毫无头绪，不知道怎么设计，怎么合成？望各位高人指点一下……
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1楼 2011-12-22 16:26:31
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
wanhscn(金币+2): 感谢分享经验 2011-12-24 17:10:51
引用回帖:
15楼: Originally posted by austin2008 at 2011-12-24 10:47:49:
你贴出的文献分别是2002和2004年的，荧光定量PCR技术发展很快的，现在的情况与以前相比，无论是准确度、灵敏度、重复性、操作稳定性和价格方面都比southern杂交检测方法好的！当然做转基因，拷贝数可能比较低，s ...

我在做realtiem pcr时候也有这个问题，即使误差控制的很小，但是也有可能出现20-30％的误差，特别是用2deltact法，多次实验结果可能不一样，对于低拷贝的材料，荧光定量是有检测下限的，不信你可以试试，如果用southern验证了单拷贝或双拷贝材料
你用realtime 作，会发现很多点在1-2这个区间上，无法分辨到底一个还是两个拷贝，因为做植物转基因考虑到后代分离的问题，所以要选单拷贝，而如你所说，微生物验证拷贝数有可能很多，比如4个拷贝和5个拷贝，即使不精细区分也许没有影响

如果你怀疑我说的，你可以去plant cell上面，看看做拟南芥和水稻的文章，找有验证拷贝数的，你会发现几乎没有用realtime的，基本都是单切southern验证～～
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17楼2011-12-24 16:39:34
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
设计引物探针，构建质粒，定量
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2楼2011-12-22 16:45:28
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-12-22 18:29:07
楼主做的是专基因检测吗？如果是，那不建议用荧光定量，主流的方法用SOUTHERN杂交。TAQMAN可以让公司设计合成，sybr法也能做，两种方法没有质变
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3楼2011-12-22 18:04:14
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-22 18:04:14:
楼主做的是专基因检测吗？如果是，那不建议用荧光定量，主流的方法用SOUTHERN杂交。TAQMAN可以让公司设计合成，sybr法也能做，两种方法没有质变

是做转基因检测，southern杂交在做，可是无法确定拷贝数，仅仅根据灰度值判断，觉得不太靠谱
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4楼2011-12-22 19:37:05
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