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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？
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flytime1115

铜虫 (初入文坛)

[求助] 有木有人做过Taqman 探针法Real-Time？？ 已有1人参与

我要检测基因组中插入的某个外源片段的拷贝数，需要做绝对定量。师兄建议不要用sybr 燃料做，建议用探针法做。现在毫无头绪，不知道怎么设计，怎么合成？望各位高人指点一下……
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1楼 2011-12-22 16:26:31
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sandisk411

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-12-24 15:28:26
TaqMAN法和SYB法都可以用于检测拷贝数，关键是你能不能设计出合适的探针。用RT-PCR法鉴定拷贝数需要你对材料非常了解，比如是转基因T0代，如果是单拷贝的，插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1:2；双拷贝的，就该是1:1；如果T1代，RT-PCR用于单株分析时，情况会很复杂，可以说你将无法准确判断，除非你已知是纯合的单株。
对于遗传背景不清楚的，你最好用SOURTHERN杂交确认，这是最可靠和简单的方法了。
要不，你可以尝试，把插入片段的左、右两边的序列给克隆测序。
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flytime1115
16楼2011-12-24 12:11:26
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sandisk411

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
单拷贝就是染色体上只有1处有外源基因。遗传背景这个词可能不是很好，容易让人混淆。我举个T-DNA转基因水稻吧，比如是转基因出来的当代是T0代水稻，其自交获得的下一代就是T1代，以此类推就是T2代，T3代.......。
在T0代时就检测拷贝数是最方便解释的，因为T-DNA框只在1条同源染色体上插入，所以插入目的基因与参考基因（基因组里单拷贝）的比值应是1:2；双拷贝的，就该是1:1；
如果是T1代的苗，比值是1:1的话，可能是单拷贝插入株的纯合植株，也可能是双拷贝植株的杂合株了。
所以，你需要知道你的材料是种植第几代了，是否是所谓的纯合了。我不知道你做的是什么材料，是水稻的话，做SOURTHERN不难的。
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19楼2011-12-26 08:18:25
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