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1楼 2011-11-21 13:38:44

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mytkkxx

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:35:40
syn1985(金币+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金币+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！补上EPI！ 2011-11-22 18:01:43

前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是说中间两个引物是反向互补的，40nt左右，也就是重叠PCR中重叠的部分

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2楼2011-11-21 18:30:38

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syn1985

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2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38:
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就 ...

我知道这两段片段是需要互补的但这片段那几么多碱基怎么设计呢

3楼2011-11-21 18:33:14

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blackrose8089

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★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-11-21 23:09:25

引用回帖:

同意mytkkxx ，同时两个片段长度可达至相近。

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syn1985

jiayoubashaonian

4楼2011-11-21 19:03:25

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4楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-11-21 19:03:25:
同意mytkkxx ，同时两个片段长度可达至相近。

我困惑的不是他们的长度是他们的碱基该怎么排列除了他们之间是需要互补的外还有其他的吗是不是自己随便列一个aggta啊啥的都行吗？

5楼2011-11-21 21:39:51

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mytkkxx

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wanhscn(金币+2): 鼓励交流 2011-11-22 10:51:00

如果它们两个是方向互补的，那引物碱基序列就只有一种可能了，就是两个片段融合的部位，第一个片段最后面20nt加第二个片段最前面20nt，不是随便列一个aggta什么的
可以看下这篇文章Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans

6楼2011-11-21 22:55:46

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6楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 22:55:46:
如果它们两个是方向互补的，那引物碱基序列就只有一种可能了，就是两个片段融合的部位，第一个片段最后面20nt加第二个片段最前面20nt，不是随便列一个aggta什么的
可以看下这篇文章Fusion PCR and gene targetin ...

谢谢啦我先看看文章不懂得再问你哈麻烦了

7楼2011-11-22 10:13:50

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西瓜(金币+2): 欢迎交流。跟2楼是一个意思。 2011-11-22 18:00:53

是叫重叠PCR吧这种PCR可以把两片段定向连起来，关键是你目的是想把两片段怎么连接上，两片段为A、B，共四条引物，其中A片段下游引物5‘端要包含B片段上游序列约20bp，B片段上游引物5’端要包含A片段下游序列约20bp，另外两引物没有特别要求按引物设计原则。PCR按说明操作。

8楼2011-11-22 13:14:39

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西瓜(金币+2): 同意！一般需要再扩增一次的。 2011-11-22 18:01:15

重叠的这段序列是自己肯定不是随便编的，你可以在引物设计软件上把你要删除的序列去掉，以此为模板设计引物，所得两段PCR产物有20bp左右的重叠即可，不过重叠部分长一点是不碍事的。
我建议你先把全长得到，再以全长为模板扩增，因为overlap PCR的引物往往特异性不好

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syn1985

9楼2011-11-22 16:43:18

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9楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-22 16:43:18:
重叠的这段序列是自己肯定不是随便编的，你可以在引物设计软件上把你要删除的序列去掉，以此为模板设计引物，所得两段PCR产物有20bp左右的重叠即可，不过重叠部分长一点是不碍事的。
我建议你先把全长得到，再以 ...

谢谢讲的还挺详细的我看文献里面也说重叠的序列flexibility 我想重叠的肯定不能随意编最起码插入这段序列不能对影响其他基因的编码，但是因为没有模板所以我不知道该怎么设计不知道可不可以以被敲除的基因序列为模板设计那2个引物互补的部分呢？