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syn1985

木虫 (正式写手)

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[求助] 做过overlap PCR的虫子过来看看

我准备用in-frame deletion 做基因敲除里面有一步是需要用overlap PCR扩增片段用以构建敲除质粒我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS
(A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介绍的时候说overlap PCR的引物设计时需要加一个tag，就是扩增的两个片段有一块是互补的，上面指写了要小于21bp，那这段序列应该是自己在设计引物加上去的，可这段序列是自己随便编一段，还是有设计依据的啊？困惑中......

PS 我不需要在这段里面加入酶切位点
谢谢各位虫子小女子在此谢过

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1楼 2011-11-21 13:38:44

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lihegang2000

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西瓜(金币+2): 同意！一般需要再扩增一次的。 2011-11-22 18:01:15

重叠的这段序列是自己肯定不是随便编的，你可以在引物设计软件上把你要删除的序列去掉，以此为模板设计引物，所得两段PCR产物有20bp左右的重叠即可，不过重叠部分长一点是不碍事的。
我建议你先把全长得到，再以全长为模板扩增，因为overlap PCR的引物往往特异性不好

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syn1985

9楼2011-11-22 16:43:18

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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)

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西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-23 17:47:31

引用回帖:

10楼: Originally posted by syn1985 at 2011-11-22 19:58:32:
谢谢讲的还挺详细的我看文献里面也说重叠的序列flexibility 我想重叠的肯定不能随意编最起码插入这段序列不能对影响其他基因的编码，但是因为没有模板所以我不知道该怎么设计不知道可不可以以被敲除的基因 ...

你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了

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11楼2011-11-23 08:43:08

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