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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过overlap PCR的虫子过来看看
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-23 17:47:31
引用回帖:
10楼: Originally posted by syn1985 at 2011-11-22 19:58:32:
谢谢 讲的还挺详细的 我看文献里面也说重叠的序列flexibility 我想重叠的肯定不能随意编 最起码插入这段序列不能对影响其他基因的编码， 但是因为没有模板  所以我不知道该怎么设计 不知道可不可以以被敲除的基因 ...

你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了
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11楼2011-11-23 08:43:08
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-23 08:43:08:
你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了

引物的3'端是定下来了 可是5‘端怎么办啊？引物设计的时候不是需要模板吗 那没有模板怎么设计啊？
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12楼2011-11-23 09:13:14
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): Good 2011-11-23 17:47:50
引用回帖:
12楼: Originally posted by syn1985 at 2011-11-23 09:13:14:
引物的3'端是定下来了 可是5‘端怎么办啊？引物设计的时候不是需要模板吗 那没有模板怎么设计啊？

5‘端好办，取离3'端20bp左右处即可
模板也好办，将原序列去掉要删除的部分，就可以做模板
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13楼2011-11-23 09:23:40
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
不过也要具体问题具体分析吧，我说的都是原则性的东西
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14楼2011-11-23 09:32:12
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dingmengdie

新虫 (初入文坛)
受益了……
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15楼2012-03-30 09:46:48
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 22:55:46
如果它们两个是方向互补的，那引物碱基序列就只有一种可能了，就是两个片段融合的部位，第一个片段最后面20nt加第二个片段最前面20nt，不是随便列一个aggta什么的
可以看下这篇文章Fusion PCR and gene targeting

这篇文章我从下不下来。不知道能否发给我一份，不胜感激，我的邮箱是：mxlo.o@163.com。先谢谢哈~
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16楼2012-05-25 10:02:40
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zfj20110603

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-23 08:43:08
你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了...

想问一下你用重叠PCR做过序列删除吗？我要缺失2700bp的片段，用重叠PCR可行吗？
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17楼2013-06-07 14:57:44
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-06-07 14:57:44
想问一下你用重叠PCR做过序列删除吗？我要缺失2700bp的片段，用重叠PCR可行吗？...

当然可以，实际上你是把两段序列拼接起来，中间的两条引物有20bp左右的互补区域就可以了。
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18楼2013-06-08 08:14:01
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zfj20110603

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lihegang2000 at 2013-06-08 08:14:01
当然可以，实际上你是把两段序列拼接起来，中间的两条引物有20bp左右的互补区域就可以了。...

谢谢！
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19楼2013-06-08 09:43:54
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sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是 ...

您好，想请教下，AB片段引物设计，其实A片段正常设计，B片段上游引物添加A片段下游20nt左右碱基就可以了吧，是否需要在A片段下游引物也添加上B片段上游20n序列呢
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20楼2013-08-30 10:50:26
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