应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过overlap PCR的虫子过来看看
202/2返回列表上一页12
查看: 4447  |  回复: 19
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 欢迎交流 2011-11-23 17:47:31
引用回帖:
10楼: Originally posted by syn1985 at 2011-11-22 19:58:32:
谢谢 讲的还挺详细的 我看文献里面也说重叠的序列flexibility 我想重叠的肯定不能随意编 最起码插入这段序列不能对影响其他基因的编码， 但是因为没有模板  所以我不知道该怎么设计 不知道可不可以以被敲除的基因 ...

你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了
赞一下(1人) 回复此楼
11楼2011-11-23 08:43:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-23 08:43:08:
你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了

引物的3'端是定下来了 可是5‘端怎么办啊？引物设计的时候不是需要模板吗 那没有模板怎么设计啊？
赞一下 回复此楼
12楼2011-11-23 09:13:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): Good 2011-11-23 17:47:50
引用回帖:
12楼: Originally posted by syn1985 at 2011-11-23 09:13:14:
引物的3'端是定下来了 可是5‘端怎么办啊？引物设计的时候不是需要模板吗 那没有模板怎么设计啊？

5‘端好办，取离3'端20bp左右处即可
模板也好办，将原序列去掉要删除的部分，就可以做模板
赞一下(1人) 回复此楼
13楼2011-11-23 09:23:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
不过也要具体问题具体分析吧，我说的都是原则性的东西
赞一下 回复此楼
14楼2011-11-23 09:32:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dingmengdie

新虫 (初入文坛)
受益了……
回复此楼
15楼2012-03-30 09:46:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mxlo.o

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 22:55:46
如果它们两个是方向互补的，那引物碱基序列就只有一种可能了，就是两个片段融合的部位，第一个片段最后面20nt加第二个片段最前面20nt，不是随便列一个aggta什么的
可以看下这篇文章Fusion PCR and gene targeting

这篇文章我从下不下来。不知道能否发给我一份，不胜感激，我的邮箱是：mxlo.o@163.com。先谢谢哈~
赞一下 回复此楼
16楼2012-05-25 10:02:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zfj20110603

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-23 08:43:08
你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了...

想问一下你用重叠PCR做过序列删除吗？我要缺失2700bp的片段，用重叠PCR可行吗？
赞一下 回复此楼
17楼2013-06-07 14:57:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zfj20110603 at 2013-06-07 14:57:44
想问一下你用重叠PCR做过序列删除吗？我要缺失2700bp的片段，用重叠PCR可行吗？...

当然可以，实际上你是把两段序列拼接起来，中间的两条引物有20bp左右的互补区域就可以了。
赞一下 回复此楼
18楼2013-06-08 08:14:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zfj20110603

金虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by lihegang2000 at 2013-06-08 08:14:01
当然可以，实际上你是把两段序列拼接起来，中间的两条引物有20bp左右的互补区域就可以了。...

谢谢！
回复此楼
19楼2013-06-08 09:43:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sarah-miao

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是 ...

您好，想请教下，AB片段引物设计，其实A片段正常设计，B片段上游引物添加A片段下游20nt左右碱基就可以了吧，是否需要在A片段下游引物也添加上B片段上游20n序列呢
赞一下 回复此楼
20楼2013-08-30 10:50:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 syn1985 的主题更新
202/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 8/400 2026-11-06 16:34 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 14/700 2026-11-06 16:32 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 17/850 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 10/500 2026-11-06 12:32 by BkA9Bi5cMhkD
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 kvewwGtKktqB 2026-11-04 11/550 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 kvewwGtKktqB 2026-11-04 14/700 2026-11-06 05:10 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +6 kvewwGtKktqB 2026-11-04 16/800 2026-11-06 05:00 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +7 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 12/600 2026-11-06 04:47 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 8/400 2026-11-06 02:24 by qL1cU46YIdK0
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:15 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 02:04 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 hNpp4Y2CGvSC 2026-11-04 12/600 2026-11-06 01:53 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭