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syn1985

木虫 (正式写手)

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[求助] 做过overlap PCR的虫子过来看看

我准备用in-frame deletion 做基因敲除里面有一步是需要用overlap PCR扩增片段用以构建敲除质粒我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS
(A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介绍的时候说overlap PCR的引物设计时需要加一个tag，就是扩增的两个片段有一块是互补的，上面指写了要小于21bp，那这段序列应该是自己在设计引物加上去的，可这段序列是自己随便编一段，还是有设计依据的啊？困惑中......

PS 我不需要在这段里面加入酶切位点
谢谢各位虫子小女子在此谢过

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1楼 2011-11-21 13:38:44

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zfj20110603

金虫 (小有名气)

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引用回帖:

11楼: Originally posted by lihegang2000 at 2011-11-23 08:43:08
你既然是要把某一段序列删除，就不需要插入什么序列了。
实际上你是把两段独立序列拼接起来，overlap PCR引物一般没什么好设计的，目的确定了，引物也就基本上定了...

想问一下你用重叠PCR做过序列删除吗？我要缺失2700bp的片段，用重叠PCR可行吗？

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17楼2013-06-07 14:57:44

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mytkkxx

木虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:35:40
syn1985(金币+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金币+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！补上EPI！ 2011-11-22 18:01:43

前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是说中间两个引物是反向互补的，40nt左右，也就是重叠PCR中重叠的部分

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2楼2011-11-21 18:30:38

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syn1985

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38:
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就 ...

我知道这两段片段是需要互补的但这片段那几么多碱基怎么设计呢

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3楼2011-11-21 18:33:14

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