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syn1985木虫 (正式写手)
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[求助]
做过overlap PCR的虫子过来看看
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我准备用in-frame deletion 做基因敲除 里面有一步是需要用overlap PCR扩增片段用以构建敲除质粒 我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS (A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介绍的时候说overlap PCR的引物设计时需要加一个tag，就是扩增的两个片段有一块是互补的，上面指写了要小于21bp，那这段序列应该是自己在设计引物加上去的，可这段序列是自己随便编一段，还是有设计依据的啊？困惑中......  PS 我不需要在这段里面加入酶切位点 谢谢各位虫子 小女子在此谢过 |
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lihegang2000
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11楼2011-11-23 08:43:08
mytkkxx
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【答案】应助回帖
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amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:35:40
syn1985(金币+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金币+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！补上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
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syn1985(金币+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金币+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！补上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
| 前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是说中间两个引物是反向互补的，40nt左右，也就是重叠PCR中重叠的部分 |
2楼2011-11-21 18:30:38
syn1985
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3楼2011-11-21 18:33:14
blackrose8089
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syn1985
4楼2011-11-21 19:03:25