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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 做过overlap PCR的虫子过来看看
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syn1985

木虫 (正式写手)

[求助] 做过overlap PCR的虫子过来看看

我准备用in-frame deletion 做基因敲除 里面有一步是需要用overlap PCR扩增片段用以构建敲除质粒 我看PROTOCOL FOR IN-FRAME DELETION MUTAGENESIS
(A. Beliaev, S.B. Reed, D. Stanek, D. Saffarini, M. Romine)里面介绍的时候说overlap PCR的引物设计时需要加一个tag，就是扩增的两个片段有一块是互补的，上面指写了要小于21bp，那这段序列应该是自己在设计引物加上去的，可这段序列是自己随便编一段，还是有设计依据的啊？困惑中......
PS 我不需要在这段里面加入酶切位点
谢谢各位虫子 小女子在此谢过
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1楼 2011-11-21 13:38:44
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lihegang2000

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 同意！一般需要再扩增一次的。 2011-11-22 18:01:15
重叠的这段序列是自己肯定不是随便编的，你可以在引物设计软件上把你要删除的序列去掉，以此为模板设计引物，所得两段PCR产物有20bp左右的重叠即可，不过重叠部分长一点是不碍事的。
我建议你先把全长得到，再以全长为模板扩增，因为overlap PCR的引物往往特异性不好
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syn1985
9楼2011-11-22 16:43:18
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mytkkxx

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流。 2011-11-21 18:35:40
syn1985(金币+20): 5 2011-11-21 21:37:54
wanhscn(金币+5): Good！ 2011-11-21 23:09:13
西瓜(MolEPI+1): Good！补上EPI！ 2011-11-22 18:01:43
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就是说中间两个引物是反向互补的，40nt左右，也就是重叠PCR中重叠的部分
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2楼2011-11-21 18:30:38
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syn1985

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38:
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就 ...

我知道这两段片段是需要互补的  但这片段那几么多碱基怎么设计呢
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3楼2011-11-21 18:33:14
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-11-21 23:09:25
引用回帖:
2楼: Originally posted by mytkkxx at 2011-11-21 18:30:38:
前不久做了下，这个不是随便加的，如果要将两个片段融合起来，那么在设计前面片段的反向引物的时候在5'端加上后面片段开始的碱基序列，大概20nt就可以了，同理在后面片段的正向引物5'端加上前面片段20nt左右。也就 ...

同意mytkkxx ，同时两个片段长度可达至相近。
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syn1985
jiayoubashaonian
4楼2011-11-21 19:03:25
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