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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序后的DNA序列与预测的有几个碱基不同，怎么办
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匿名

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【分子生物】EPI帖 测序相关问题

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1楼 2011-08-29 20:33:47
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匿名

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2楼2011-08-29 20:44:08
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-30 08:03:04
facingworld(金币+2): 好人呀！我也打算在送几个克隆去看看，还想问问，永久军也能不能反复冻融呀！这个如果要测序我要送永久菌液呀！ 2011-08-30 08:55:01
金斯瑞在生物行业已经是一家相当牛的公司了，你看一下测序图，如果每个碱基都测的不错的话那你的序列就是这样子了。给你提供以下方案：
1.多送测几个克隆，如果测的结果跟这次一致，那么没必要重新扩增了。
2.如果必须要得到理想中的序列，那就需要做突变修复。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-08-29 21:06:09
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 08:03:24
facingworld(金币+1): 又是一个好人呀！624位有一个T-A的突变 870位有一个A-G的突变，1412位有一个C-T的突变，1950位有个G-T的突变，这些算测序开始的突变吗？ 2011-08-30 09:01:59
测序一般每个反应开始都不准确，首先排除这个因素。同意楼上的同时送几个测序进行比较，用高保真的酶再做一次，修复突变比较麻烦。
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4楼2011-08-29 21:51:12
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个应该是PCR过程中产生的突变吧，扩增时少几个循环
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5楼2011-08-30 09:39:18
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匿名

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6楼2011-08-30 09:41:15
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yemuren

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-30 18:34:20
facingworld(金币+1): 谢谢啦！我刚看了一下，突变处的峰值信号都很强，估计我P的有问题咯，重新吧！ 2011-08-30 21:22:40
首先，你可以看看测序图谱，如果突变碱基处峰图信号强，没有杂峰，说明测序是没有问题的，那就应该是PCR过程中突变了，然后你可以做以下选择：
1：设计诱变引物，把突变位点诱变回去，这个有点麻烦，耗时长，不推荐使用；2：使用高保真酶，重P一次，然后用普通的Tag酶加上a尾巴，就可以做TA克隆测序了。循环数少一些，30足够了。
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我的专长叫做流浪，所以我就做了流氓~
7楼2011-08-30 10:34:07
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-08-30 18:34:35
排除测序问题后，换高保真的酶PCR并减少PCR循环次数，次数越多，突变越多，我试过25个循环的，突变概率小多了。我的也是2100+ bp
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8楼2011-08-30 10:45:40
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): good 2011-08-30 18:34:46
对的，我扩增时一般都是26－28个循环，也扩过2000+的
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9楼2011-08-30 11:04:05
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

扩的条带弱一点没关系，连T还是好连的
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10楼2011-08-30 11:05:18
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