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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序后的DNA序列与预测的有几个碱基不同，怎么办
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jushi0619

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 欢迎新虫交流 2011-08-30 18:35:24
你可以看下测序图谱，如果图形没问题的话那应该就不会测错了，考虑重新P吧
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11楼2011-08-30 15:01:09
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 确实，我们在他家测序也出过问题 2011-08-30 18:35:50
也有可能是PCR过程出错，金斯瑞测序一般，之前送了几个RNAi载体测序，因为是发卡结构，死活测不出来，换了其它公司一下就搞定～
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12楼2011-08-30 15:11:10
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lixingliang

新虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-31 17:06:53
我在克隆时也遇到此类问题，后来重复试验，发现总是有这几个改变，这就证明试验没有问题，有可能是另外一个转录本。
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我不管你看起看不起我，我都是个演员
13楼2011-08-31 14:45:10
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匿名

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14楼2011-08-31 20:25:13
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匿名

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15楼2011-08-31 20:25:31
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wzqno

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-09-01 18:19:24
一般PCR不要超过30个循环，用宝生物的LATaq酶试试？？你送一次测序都是几个样啊？？我一般一次送五个克隆的样品，也有突变的，不过每个都是在不同位置的突变，不过还好，一般都有一个到两个是100% 正确的，如果没有的话，再送几个克隆样品，总会有正确的。不过如果几个样品得到的结果很一致，那就说明样品确实有问题，重新PCR吧。金斯瑞我一直在用，除了慢点，还挺好的，和上海生工，华大测序都是一样的仪器，没问题的
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facingworld
16楼2011-09-01 09:31:07
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匿名

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17楼2011-09-04 21:06:02
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wzqno

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助！ 2011-12-13 18:55:17
引用回帖:
17楼: Originally posted by facingworld at 2011-09-04 21:06:02:
这几天有点忙，嘿嘿，送小红花一朵吧！这个克隆做的很纠结，我用的是TakaRa的载体和感受态细胞，但是一直长得斑很少，只有十几个，不知道是什么原因，并且阳性克隆就这么一两个，并且测序有问题，究竟是什么地方 ...

你可以自己做感受态啊，我一直都是自己做的，效果不错，如果转化成功的话都能长上几百个克隆，基本上随便挑十个克隆，有阳性的话就送测序，如果没有，基本上就重新做感受态，转化。
        制备感受态方法
1.Top10甘油菌液50ul接种4ml LB液体培养基（无氨苄），300rpm,过夜培养；
2.取过夜培养的Top10 菌液500ul接种 5ml LB液体培养基（无氨苄），300rpm，2h；这时就算是对数期细菌了。
3.取对数期菌液分次放入1.5ml无菌离心管中共计5ml，5500 rpm离心1 min；
4.弃上清，用500ul预冷的0.1M CaCl2重悬细菌沉淀【动作轻柔，可用枪头轻微搅动，吹打动作需轻柔】，至无明显菌块，5500 rpm离心1 min；
5.弃上清，再向细菌沉淀中加入500ul预冷的0.1M CaCl2，混匀，冰浴30min，待用。
6.然后就可以做转化了，一般热激60-70s就可以了
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18楼2011-09-05 08:47:16
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baby0032

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-30 15:11:10:
也有可能是PCR过程出错，金斯瑞测序一般，之前送了几个RNAi载体测序，因为是发卡结构，死活测不出来，换了其它公司一下就搞定～

请问楼主测序的是什么公司啊？
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19楼2011-12-13 16:41:30
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