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jushi0619

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 欢迎新虫交流 2011-08-30 18:35:24
你可以看下测序图谱,如果图形没问题的话那应该就不会测错了,考虑重新P吧
11楼2011-08-30 15:01:09
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


西瓜(金币+1): 确实,我们在他家测序也出过问题 2011-08-30 18:35:50
也有可能是PCR过程出错,金斯瑞测序一般,之前送了几个RNAi载体测序,因为是发卡结构,死活测不出来,换了其它公司一下就搞定~
12楼2011-08-30 15:11:10
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lixingliang

新虫 (小有名气)

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-31 17:06:53
我在克隆时也遇到此类问题,后来重复试验,发现总是有这几个改变,这就证明试验没有问题,有可能是另外一个转录本。
我不管你看起看不起我,我都是个演员
13楼2011-08-31 14:45:10
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匿名

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14楼2011-08-31 20:25:13
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匿名

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15楼2011-08-31 20:25:31
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wzqno

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-09-01 18:19:24
一般PCR不要超过30个循环,用宝生物的LATaq酶试试??你送一次测序都是几个样啊??我一般一次送五个克隆的样品,也有突变的,不过每个都是在不同位置的突变,不过还好,一般都有一个到两个是100% 正确的,如果没有的话,再送几个克隆样品,总会有正确的。不过如果几个样品得到的结果很一致,那就说明样品确实有问题,重新PCR吧。金斯瑞我一直在用,除了慢点,还挺好的,和上海生工,华大测序都是一样的仪器,没问题的

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16楼2011-09-01 09:31:07
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匿名

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送鲜花一朵
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17楼2011-09-04 21:06:02
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wzqno

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助! 2011-12-13 18:55:17
引用回帖:
17楼: Originally posted by facingworld at 2011-09-04 21:06:02:
这几天有点忙,嘿嘿,送小红花一朵吧!这个克隆做的很纠结,我用的是TakaRa的载体和感受态细胞,但是一直长得斑很少,只有十几个,不知道是什么原因,并且阳性克隆就这么一两个,并且测序有问题,究竟是什么地方 ...

你可以自己做感受态啊,我一直都是自己做的,效果不错,如果转化成功的话都能长上几百个克隆,基本上随便挑十个克隆,有阳性的话就送测序,如果没有,基本上就重新做感受态,转化。
        制备感受态方法
1.Top10甘油菌液50ul接种4ml LB液体培养基(无氨苄),300rpm,过夜培养;
2.取过夜培养的Top10 菌液500ul接种 5ml LB液体培养基(无氨苄),300rpm,2h;这时就算是对数期细菌了。
3.取对数期菌液分次放入1.5ml无菌离心管中共计5ml,5500 rpm离心1 min;
4.弃上清,用500ul预冷的0.1M CaCl2重悬细菌沉淀【动作轻柔,可用枪头轻微搅动,吹打动作需轻柔】,至无明显菌块,5500 rpm离心1 min;
5.弃上清,再向细菌沉淀中加入500ul预冷的0.1M CaCl2,混匀,冰浴30min,待用。
6.然后就可以做转化了,一般热激60-70s就可以了
18楼2011-09-05 08:47:16
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baby0032

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by shaquila at 2011-08-30 15:11:10:
也有可能是PCR过程出错,金斯瑞测序一般,之前送了几个RNAi载体测序,因为是发卡结构,死活测不出来,换了其它公司一下就搞定~

请问楼主测序的是什么公司啊?
19楼2011-12-13 16:41:30
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