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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序后的DNA序列与预测的有几个碱基不同，怎么办
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匿名

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1楼 2011-08-29 20:33:47
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wzqno

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助！ 2011-12-13 18:55:17
引用回帖:
17楼: Originally posted by facingworld at 2011-09-04 21:06:02:
这几天有点忙，嘿嘿，送小红花一朵吧！这个克隆做的很纠结，我用的是TakaRa的载体和感受态细胞，但是一直长得斑很少，只有十几个，不知道是什么原因，并且阳性克隆就这么一两个，并且测序有问题，究竟是什么地方 ...

你可以自己做感受态啊，我一直都是自己做的，效果不错，如果转化成功的话都能长上几百个克隆，基本上随便挑十个克隆，有阳性的话就送测序，如果没有，基本上就重新做感受态，转化。
        制备感受态方法
1.Top10甘油菌液50ul接种4ml LB液体培养基（无氨苄），300rpm,过夜培养；
2.取过夜培养的Top10 菌液500ul接种 5ml LB液体培养基（无氨苄），300rpm，2h；这时就算是对数期细菌了。
3.取对数期菌液分次放入1.5ml无菌离心管中共计5ml，5500 rpm离心1 min；
4.弃上清，用500ul预冷的0.1M CaCl2重悬细菌沉淀【动作轻柔，可用枪头轻微搅动，吹打动作需轻柔】，至无明显菌块，5500 rpm离心1 min；
5.弃上清，再向细菌沉淀中加入500ul预冷的0.1M CaCl2，混匀，冰浴30min，待用。
6.然后就可以做转化了，一般热激60-70s就可以了
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18楼2011-09-05 08:47:16
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匿名

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2楼2011-08-29 20:44:08
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-30 08:03:04
facingworld(金币+2): 好人呀！我也打算在送几个克隆去看看，还想问问，永久军也能不能反复冻融呀！这个如果要测序我要送永久菌液呀！ 2011-08-30 08:55:01
金斯瑞在生物行业已经是一家相当牛的公司了，你看一下测序图，如果每个碱基都测的不错的话那你的序列就是这样子了。给你提供以下方案：
1.多送测几个克隆，如果测的结果跟这次一致，那么没必要重新扩增了。
2.如果必须要得到理想中的序列，那就需要做突变修复。
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-08-29 21:06:09
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 08:03:24
facingworld(金币+1): 又是一个好人呀！624位有一个T-A的突变 870位有一个A-G的突变，1412位有一个C-T的突变，1950位有个G-T的突变，这些算测序开始的突变吗？ 2011-08-30 09:01:59
测序一般每个反应开始都不准确，首先排除这个因素。同意楼上的同时送几个测序进行比较，用高保真的酶再做一次，修复突变比较麻烦。
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4楼2011-08-29 21:51:12
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