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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变出现的问题出现重复序列
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zcf1990

银虫 (初入文坛)

[交流] 定点突变出现的问题出现重复序列

我在做定点突变出现以下问题：我想讲227位的F突变成S其序列入下图：

ACCAGAGCCATTCTGCAAAGTGGTTCCSample TextAATGCTCCTTGGGCGGCCATTCTGCAAAGTGGTT
CCSample TextAATGCTCCTTGGGCGGGCCATTCTGCAAAGTGGTTCCTCCAATGCTCCTTGGGCGGTGCCATTCTGCAAAGTGGT
TCCTCCAATGCTCCT
红色为突变的点，氨基酸突变没有问题，可是长度却重复了相同的引物长度4次，不知道哪里出了问题~~求解~~
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1楼 2013-07-24 14:22:54
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ccharlien

木虫 (正式写手)
引用回帖:
20楼: Originally posted by zcf1990 at 2013-07-26 08:26:06
我们实验室两个不同方向的定点突变都碰到这种问题，而且是不同的人不同时间做的反应，先前怀疑是反应的buffer或者是试剂有问题，可是换了之后还是没有解决这个问题~~真心希望碰到过的朋友帮忙解决下，要不然一直在 ...

我觉得要么是pcr程序问题要么是引物的问题
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21楼2013-07-26 15:36:27
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personalpc

金虫 (著名写手)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
帮顶
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5楼2013-07-24 15:24:27
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 16:41:27
PCR过程中引入的，连续几段突变引物，重新挑取其他克隆测序，肯定有正常突变的。
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8楼2013-07-24 16:20:33
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bullfrog325

木虫 (正式写手)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
一楼正解, 多挑几个克隆就成
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11楼2013-07-24 18:03:38
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-07-24 16:20:33
PCR过程中引入的，连续几段突变引物，重新挑取其他克隆测序，肯定有正常突变的。

不止一次出现，有没有办法抵制这种现象的发生~~我小老板说他做克隆从来没出现这种现象，还说他的克隆只挑一个，而且都是对的~~
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13楼2013-07-24 20:55:46
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
zcf1990: 金币+2, 现在重新做，希望能减少这种现象的产生~~ 2013-07-25 08:34:08
引用回帖:
13楼: Originally posted by zcf1990 at 2013-07-24 20:55:46
不止一次出现，有没有办法抵制这种现象的发生~~我小老板说他做克隆从来没出现这种现象，还说他的克隆只挑一个，而且都是对的~~...

减少模板和引物的用量，同时循环数减少到20-25循环。
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14楼2013-07-25 07:50:55
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amalio

银虫 (小有名气)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
很正常，我也遇见过！但是一般只插入一段引物，而且有的还是正常的，像楼主这样的还是很少见！
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15楼2013-07-25 09:33:30
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by amalio at 2013-07-25 09:33:30
很正常，我也遇见过！但是一般只插入一段引物，而且有的还是正常的，像楼主这样的还是很少见！

那你有没有克服这个问题 ，据小老板说他做一次对一次，重来没遇到过~~
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17楼2013-07-25 17:29:25
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ccharlien

木虫 (正式写手)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
17楼: Originally posted by zcf1990 at 2013-07-25 17:29:25
那你有没有克服这个问题 ，据小老板说他做一次对一次，重来没遇到过~~...

你小老板说的也不算夸张了
我做的十几次定点突变质粒 也没遇到过你这情况
一般挑三个测序 至少两个是对的
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18楼2013-07-26 04:48:40
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zcf1990

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
18楼: Originally posted by ccharlien at 2013-07-26 04:48:40
你小老板说的也不算夸张了
我做的十几次定点突变质粒 也没遇到过你这情况
一般挑三个测序 至少两个是对的...

我们实验室两个不同方向的定点突变都碰到这种问题，而且是不同的人不同时间做的反应，先前怀疑是反应的buffer或者是试剂有问题，可是换了之后还是没有解决这个问题~~真心希望碰到过的朋友帮忙解决下，要不然一直在这个问题上纠结~·
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20楼2013-07-26 08:26:06
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amalio

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by zcf1990 at 2013-07-25 17:29:25
那你有没有克服这个问题 ，据小老板说他做一次对一次，重来没遇到过~~...

我的只是偶尔出现没有去管它
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22楼2013-07-27 14:44:22
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王冠傑

铁虫 (小有名气)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
引物合成纯度不可能达到100%，你的小老板运气实在是太好了。一半多挑几个克隆就行。
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23楼2015-05-11 08:37:34
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Evelyn19

新虫 (初入文坛)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
楼主现在有解决这个问题的办法了吗
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24楼2015-12-14 11:56:05
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jinshengfang

木虫 (正式写手)
★
zcf1990(金币+1): 谢谢参与
我p质粒突变也出现了跟楼主一样的问题，我的引物序列重复了一次，请问楼主解决问题了吗？多挑几个送测序就能对吗？
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25楼2016-01-05 11:28:46
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3305754152楼
2013-07-24 14:58   回复  
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chenleilei3楼
2013-07-24 15:04   回复  
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