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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接PCR检测
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 连接PCR检测

对连接转化挑取的菌液进行PCR反应，为了验证连接成功，扩增载体上的目的基因2000bp, 为什么会出来小分子量1000左右的条带啊 ，是PCR的问题，还是我的连接失败啊，原因在何处啊？



各位高手帮着分析一下啊
谢谢了
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1楼 2011-08-08 08:17:43
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-08 18:16:42
出现过同样的问题，
可能是引物特异性不好，扩增出载体的部分片段造成的，建议选择一两个亮点的，提质粒酶切鉴定看看。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-08-08 08:38:26
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-08-08 18:16:54
你之前PCR的时候很完整么？？还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的？？怀疑你的引物有问题，特异性不好
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3楼2011-08-08 09:31:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:04
1.可能是你的引物特异性不好，在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了，再做的酶切验证一下
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-08-08 09:38:41
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wzqno at 2011-08-08 09:31:57:
你之前PCR的时候很完整么？？还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的？？怀疑你的引物有问题，特异性不好

之前做克隆时PCR可以出现目的条带，我是通过酶切位点连接的。如果是假阳性，那么出现的原因有可能是什么呢？
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5楼2011-08-08 10:01:40
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-08 09:38:41:
1.可能是你的引物特异性不好，在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了，再做的酶切验证一下

您的意思是扩增出其他位置的非目的基因片段？ 由此也可推断目的基因可能连上了。   有没有可能会扩增到载体某个位置的片段啊？
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6楼2011-08-08 10:07:09
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-08-08 10:07:09:
您的意思是扩增出其他位置的非目的基因片段？ 由此也可推断目的基因可能连上了。   有没有可能会扩增到载体某个位置的片段啊？

我看到你的图上有两条片段啊，难道没有目的片段的条带？你最好能把mark的条带标一下
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7楼2011-08-08 11:25:51
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:20
暗夜懒猫(金币+1): 2011-08-25 08:13:55
这种情况我很少遇到，不过你可以进一步进行一下提质粒，然后双酶切验证一下；
或者重新进行连接，然后进行PCR验证，不过按照你图中那些条带应该都是你选取的样进行PCR的吧？我就很奇怪了，为什么P出来的大小基本都一样呢？如果是非特异性的话，那么不应该全部都是非特异性的；
建议你先提取质粒酶切看看，然后再做定夺。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2011-08-08 11:28:08
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-08-08 11:25:51:
我看到你的图上有两条片段啊，难道没有目的片段的条带？你最好能把mark的条带标一下

加样孔在下面，那最上面的是引物二聚体吧，可能就是因为引物特异性不好，所以剩余的引物形成二聚体了，不过既然之前PCR克隆基因的时候都没问题，这就比较费解了
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9楼2011-08-08 14:55:31
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-08-08 10:01:40:
之前做克隆时PCR可以出现目的条带，我是通过酶切位点连接的。如果是假阳性，那么出现的原因有可能是什么呢？

我又看了一遍电泳结果，如果你用的是DL2000 DNA marker的话，出现的条带只有600-700bp，没有你说的1000bp吧？？之前测序过没？？之前PCR的时候，你确定扩增产物是2000bp左右？？怀疑你是不是用错引物了？？
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10楼2011-08-08 15:03:20
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