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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 连接PCR检测

对连接转化挑取的菌液进行PCR反应，为了验证连接成功，扩增载体上的目的基因2000bp, 为什么会出来小分子量1000左右的条带啊 ，是PCR的问题，还是我的连接失败啊，原因在何处啊？



各位高手帮着分析一下啊
谢谢了
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1楼 2011-08-08 08:17:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:20
暗夜懒猫(金币+1): 2011-08-25 08:13:55
这种情况我很少遇到，不过你可以进一步进行一下提质粒，然后双酶切验证一下；
或者重新进行连接，然后进行PCR验证，不过按照你图中那些条带应该都是你选取的样进行PCR的吧？我就很奇怪了，为什么P出来的大小基本都一样呢？如果是非特异性的话，那么不应该全部都是非特异性的；
建议你先提取质粒酶切看看，然后再做定夺。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2011-08-08 11:28:08
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-08 18:16:42
出现过同样的问题，
可能是引物特异性不好，扩增出载体的部分片段造成的，建议选择一两个亮点的，提质粒酶切鉴定看看。
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Thank-you，so-blue.
2楼2011-08-08 08:38:26
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-08-08 18:16:54
你之前PCR的时候很完整么？？还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的？？怀疑你的引物有问题，特异性不好
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3楼2011-08-08 09:31:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:04
1.可能是你的引物特异性不好，在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了，再做的酶切验证一下
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-08-08 09:38:41
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