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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接PCR检测
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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 连接PCR检测

对连接转化挑取的菌液进行PCR反应，为了验证连接成功，扩增载体上的目的基因2000bp, 为什么会出来小分子量1000左右的条带啊 ，是PCR的问题，还是我的连接失败啊，原因在何处啊？



各位高手帮着分析一下啊
谢谢了
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1楼 2011-08-08 08:17:43
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-08-08 10:01:40:
之前做克隆时PCR可以出现目的条带，我是通过酶切位点连接的。如果是假阳性，那么出现的原因有可能是什么呢？

我又看了一遍电泳结果，如果你用的是DL2000 DNA marker的话，出现的条带只有600-700bp，没有你说的1000bp吧？？之前测序过没？？之前PCR的时候，你确定扩增产物是2000bp左右？？怀疑你是不是用错引物了？？
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10楼2011-08-08 15:03:20
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-08 18:16:42
出现过同样的问题，
可能是引物特异性不好，扩增出载体的部分片段造成的，建议选择一两个亮点的，提质粒酶切鉴定看看。
赞一下(1人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
2楼2011-08-08 08:38:26
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-08-08 18:16:54
你之前PCR的时候很完整么？？还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的？？怀疑你的引物有问题，特异性不好
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3楼2011-08-08 09:31:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:04
1.可能是你的引物特异性不好，在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了，再做的酶切验证一下
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-08-08 09:38:41
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