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暗夜懒猫

银虫 (小有名气)

[求助] 连接PCR检测

对连接转化挑取的菌液进行PCR反应,为了验证连接成功,扩增载体上的目的基因2000bp, 为什么会出来小分子量1000左右的条带啊 ,是PCR的问题,还是我的连接失败啊,原因在何处啊?



各位高手帮着分析一下啊
谢谢了
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 暗夜懒猫 at 2011-08-08 10:01:40:
之前做克隆时PCR可以出现目的条带,我是通过酶切位点连接的。如果是假阳性,那么出现的原因有可能是什么呢?

我又看了一遍电泳结果,如果你用的是DL2000 DNA marker的话,出现的条带只有600-700bp,没有你说的1000bp吧??之前测序过没??之前PCR的时候,你确定扩增产物是2000bp左右??怀疑你是不是用错引物了??
10楼2011-08-08 15:03:20
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-08 18:16:42
出现过同样的问题,
可能是引物特异性不好,扩增出载体的部分片段造成的,建议选择一两个亮点的,提质粒酶切鉴定看看。
Thank-you,so-blue.
2楼2011-08-08 08:38:26
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-08-08 18:16:54
你之前PCR的时候很完整么??还有你连得是T载体还是通过酶切位点连接的??怀疑你的引物有问题,特异性不好
3楼2011-08-08 09:31:57
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:17:04
1.可能是你的引物特异性不好,在模板的其他位置有非特异性扩增
2.还有一个原因是气溶胶的污染
你的目的条带已经扩出来说明应该是连上了,再做的酶切验证一下
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
4楼2011-08-08 09:38:41
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