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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 设计引物时酶切位点保护碱基的问题
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肉丸001

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] 设计引物时酶切位点保护碱基的问题

我想在毕赤酵母表达蛋白，用的是pPTC9K，因为目标蛋白中有SnaBI和EcoRI,所以只能用两相邻的AvrII和NotI酶切位点。设计引物的时候找不到AvrII的保护碱基，求助。
    同时也听师兄说保护碱基的格式是有规定的（http://wenku.baidu.com/view/e596a5dba58da0116c1749bf.html参照这个表）。但我之前设计引物的时候都是随便来的，像BamHI我只是象征性的添加几个GC，只要无发夹结构、二聚体就行了，而且也都能p出来。所以我困惑了，保护碱基到底有啥要求？必须按照那个表来，碱基数目及排列都必须一样？

  毕赤酵母组氨酸偏爱密码子为CAC，为减小引物Tm值我选用CAT可否，会影响表达效率么？
  求高手指导，最好能给个QQ进一步咨询。。。

[ Last edited by 肉丸001 on 2011-7-7 at 19:28 ]
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1楼 2011-07-07 19:04:56
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wurenzhi0721

铁虫 (正式写手)
楼主，我也要用这个载体，请问你现在做得怎么样了？
我用的也是跟你一样：两相邻的AvrII和NotI酶切位点
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你快乐所以我快乐，我快乐所以大家也快乐
6楼2011-12-06 15:26:14
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查看全部 9 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
肉丸001(金币+5): 谢谢。。 2011-07-07 20:23:56
dhd997(金币+3): 2011-07-08 08:12:12
保护碱基的问题，真的是随便放几个就ok了。有些特殊的酶需要比较长的保护碱基，但是一般常用的酶（您用的BamH I也是），放3个以上就可以了，可以调整碱基类型和数目，达到调整引物Tm值和GC含量的目的。
关于保护碱基那个表，最早好像是NEB搞出来的，造成了一些迷信。NEB以前的产品目录是有那个表的，但是近年来的产品目录都取消了，因为他们也意识到没必要纠结保护碱基。这个表，你可以看，如果发现你要用的酶活力都很低，那么你就把保护碱基加到5个以上，不放心可以照着表上的去做，但一般的酶加3个就够用了。

后面的问题我不懂哈
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2楼2011-07-07 19:50:59
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肉丸001

捐助贵宾 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-07-07 19:50:59:
保护碱基的问题，真的是随便放几个就ok了。有些特殊的酶需要比较长的保护碱基，但是一般常用的酶（您用的BamH I也是），放3个以上就可以了，可以调整碱基类型和数目，达到调整引物Tm值和GC含量的目的。
关于保护 ...

我用PCR加组氨酸标签可以少加几个么？我看质粒图谱中都是加6个的，我的目标蛋白是126个氨基酸
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3楼2011-07-07 20:25:18
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 是没什么大关系啦，实践检验过的。 2011-07-07 21:43:06
肉丸001(金币+3): 2011-07-07 22:03:39
肉丸001(金币+2): 2011-07-24 11:22:22
个人觉得没有什么需要注意的，只要加完之后平衡两个引物的TM值和GC含量就可以了。。。GCAT无所谓，但是加完之后还是用软件分析一下为好。。。
赞一下(1人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-07-07 20:55:48
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