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肉丸001

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[求助] 设计引物时酶切位点保护碱基的问题

我想在毕赤酵母表达蛋白，用的是pPTC9K，因为目标蛋白中有SnaBI和EcoRI,所以只能用两相邻的AvrII和NotI酶切位点。设计引物的时候找不到AvrII的保护碱基，求助。
同时也听师兄说保护碱基的格式是有规定的（http://wenku.baidu.com/view/e596a5dba58da0116c1749bf.html参照这个表）。但我之前设计引物的时候都是随便来的，像BamHI我只是象征性的添加几个GC，只要无发夹结构、二聚体就行了，而且也都能p出来。所以我困惑了，保护碱基到底有啥要求？必须按照那个表来，碱基数目及排列都必须一样？

毕赤酵母组氨酸偏爱密码子为CAC，为减小引物Tm值我选用CAT可否，会影响表达效率么？
求高手指导，最好能给个QQ进一步咨询。。。

[ Last edited by 肉丸001 on 2011-7-7 at 19:28 ]

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1楼2011-07-07 19:04:56

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西瓜

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
肉丸001(金币+5): 谢谢。。 2011-07-07 20:23:56
dhd997(金币+3): 2011-07-08 08:12:12

保护碱基的问题，真的是随便放几个就ok了。有些特殊的酶需要比较长的保护碱基，但是一般常用的酶（您用的BamH I也是），放3个以上就可以了，可以调整碱基类型和数目，达到调整引物Tm值和GC含量的目的。
关于保护碱基那个表，最早好像是NEB搞出来的，造成了一些迷信。NEB以前的产品目录是有那个表的，但是近年来的产品目录都取消了，因为他们也意识到没必要纠结保护碱基。这个表，你可以看，如果发现你要用的酶活力都很低，那么你就把保护碱基加到5个以上，不放心可以照着表上的去做，但一般的酶加3个就够用了。

后面的问题我不懂哈

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2楼2011-07-07 19:50:59

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引用回帖:

Originally posted by 西瓜 at 2011-07-07 19:50:59:
保护碱基的问题，真的是随便放几个就ok了。有些特殊的酶需要比较长的保护碱基，但是一般常用的酶（您用的BamH I也是），放3个以上就可以了，可以调整碱基类型和数目，达到调整引物Tm值和GC含量的目的。
关于保护 ...

我用PCR加组氨酸标签可以少加几个么？我看质粒图谱中都是加6个的，我的目标蛋白是126个氨基酸

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3楼2011-07-07 20:25:18

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