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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达标签的切除，及信号肽的影响
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youngsun50

木虫 (正式写手)

[求助] 原核表达标签的切除，及信号肽的影响

请问高手，我的蛋白序列（G-细菌的）预测着在前28位为信号肽，可能分泌到周质中发挥作用，请问：
1）如果要做酶动力学及用此纯化蛋白（酶）体外反应体系筛化合物，要不要把信号肽去掉，即直接表达的蛋白序列为（29-后）。若表达全序列，信号肽对酶动力及蛋白结构影响大吗？
2）要去掉his-tag（杂志要求的），一般用啥酶切好，能够尽可能甚至无剩余氨基酸，而且酶切效率高，及酶切时目的蛋白损失少，蛋白酶好去除。请推荐蛋白酶及相应载体。
   谢谢
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学会感恩，强大自我
1楼2011-05-16 22:10:36
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-17 08:39:11
1、信号肽未切割影响蛋白的空间结构，也影响蛋白的性质，包括活性，异源表达一般是表达成熟肽部分的，因为原来的信号肽不能被识别和切割。
2、用肠激酶EK，切割后无剩余氨基酸，构建融合基因时把his-tag编码序列加5‘端，然后肠激酶酶切位点（DDDDK）编码序列，再后面就是你的成熟肽编码序列，表达后就是his-tag-DDDDK-成熟肽，酶切在K后面，得到无剩余氨基酸的成熟肽，没切割或者切割剩下的his-tag-DDDDK可以亲和层析去除。
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2楼2011-05-17 07:43:13
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youngsun50

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-05-17 07:43:13:
1、信号肽未切割影响蛋白的空间结构，也影响蛋白的性质，包括活性，异源表达一般是表达成熟肽部分的，因为原来的信号肽不能被识别和切割。
2、用肠激酶EK，切割后无剩余氨基酸，构建融合基因时把his-tag编码序列 ...

谢谢，请问你之前用过EK酶切吗，我看网上有的说EK酶切效率低，相对较昂贵，且酶切后回收时形成沉淀，蛋白损失大。另，EK酶怎么去除呢。能详细说一下吗
谢谢
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学会感恩，强大自我
3楼2011-05-17 09:19:25
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
youngsun50(金币+2): 2011-05-17 13:05:08
西瓜(金币+3): 鼓励！ 2011-05-17 16:45:54
youngsun50(金币+3): 2011-05-19 16:52:41
引用回帖:
Originally posted by youngsun50 at 2011-05-17 09:19:25:
谢谢，请问你之前用过EK酶切吗，我看网上有的说EK酶切效率低，相对较昂贵，且酶切后回收时形成沉淀，蛋白损失大。另，EK酶怎么去除呢。能详细说一下吗
谢谢

用过，我们EK自己工程菌制备的。EK效率挺高的，酶切后是否形成沉淀跟目标蛋白性质有关系的。EK的去除用STI亲和层析或者苯甲醚柱亲和层析，流穿就去除EK了。
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4楼2011-05-17 10:32:36
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yipinyoulan

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1225633楼: Originally posted by lxj341401 at 2011-05-17 07:43:13
1、信号肽未切割影响蛋白的空间结构，也影响蛋白的性质，包括活性，异源表达一般是表达成熟肽部分的，因为原来的信号肽不能被识别和切割。
2、用肠激酶EK，切割后无剩余氨基酸，构建融合基因时把his-tag编码序列加 ...

本人新手，做分泌表达，请问下：信号肽（SP）是加在his-tag的前面，还是成熟肽前面？也就是说是这样吗——SP-his-tag-DDDDK-成熟肽？
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5楼2012-09-21 14:30:13
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
1578134楼: Originally posted by yipinyoulan at 2012-09-21 14:30:13
本人新手，做分泌表达，请问下：信号肽（SP）是加在his-tag的前面，还是成熟肽前面？也就是说是这样吗——SP-his-tag-DDDDK-成熟肽？...

信号肽（SP）在N端。
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6楼2012-09-21 20:45:26
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