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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 求助肠激酶酶切融合蛋白
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michacel1217

银虫 (小有名气)

[求助] 求助肠激酶酶切融合蛋白 已有1人参与

现在在做一个融合蛋白（序列，表达都正确），带有肠激酶位点，位于两个蛋白中间，想经肠激酶切割后获得肠激酶后面的蛋白，试了不同的反应体系（融合蛋白过量、酶过量都尝试过，看到有的文献Buffer里加有Tween，也都试过，始终切割不下来），做考染始终无法看出，其中，肠激酶已证明有活性。后来我将融合蛋白煮沸10min，再做酶切，可以看见在预期大小的位置有一条微弱的带，但是因为煮沸后蛋白肯定变性，无法用于后期的细胞实验，所以煮沸方法不可取。故想请教各位大神，有什么好的办法或者思路，望大家帮忙指点，不胜感激。
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1楼 2015-03-09 17:04:04
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匿名

本帖仅楼主可见
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2楼2015-03-10 13:40:02
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michacel1217

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 立林258369 at 2015-03-10 13:40:02
我做融合表达蛋白，用凝血酶来切掉gst
标签，你是在柱子上切的吗？

不是，我是将融合蛋白纯化冻干后重新溶解，再使用肠激酶酶切。
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3楼2015-03-10 16:49:43
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luliangwmll

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么要冻干后重新溶解，肠激酶还是很好切的。你要看看你的肠激酶来源是否可靠，酶切buffer是否正确。
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4楼2015-03-10 23:07:30
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luliangwmll

新虫 (初入文坛)
亲，你的融合蛋白有3c酶酶切位点吗？如果有我们可以免费给你提供些3C酶的试用装，柱上切或者溶液体系切都没问题。
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5楼2015-03-10 23:09:08
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michacel1217

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luliangwmll at 2015-03-10 23:07:30
为什么要冻干后重新溶解，肠激酶还是很好切的。你要看看你的肠激酶来源是否可靠，酶切buffer是否正确。

纯化后得到的融合蛋白浓度太低，做酶切实验几乎都看不清条带，所以采用冻干后得到浓度较高的蛋白做酶切实验。肠激酶是由毕赤酵母发酵而得到的，并且已经证明能够切割其他带有肠激酶位点的蛋白，酶切Buffer为Tris-HCl，PH8.0，10mM CaCl2，也试过加有Tween的酶切Buffer，
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6楼2015-03-11 00:32:40
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michacel1217

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by luliangwmll at 2015-03-10 23:09:08
亲，你的融合蛋白有3c酶酶切位点吗？如果有我们可以免费给你提供些3C酶的试用装，柱上切或者溶液体系切都没问题。

我们是想经肠激酶切割后得到纯的目的蛋白，不想获得目的蛋白前再加有氨基酸的融合蛋白
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7楼2015-03-11 00:34:35
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xiaoyanzi14

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by michacel1217 at 2015-03-11 00:34:35
我们是想经肠激酶切割后得到纯的目的蛋白，不想获得目的蛋白前再加有氨基酸的融合蛋白...

你好，我用肠激酶切带标签的融合蛋白，刚开始还没切，请问你的问题解决了吗，你用的什么酶切体系？
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8楼2015-03-19 10:05:42
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michacel1217

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by xiaoyanzi14 at 2015-03-19 10:05:42
你好，我用肠激酶切带标签的融合蛋白，刚开始还没切，请问你的问题解决了吗，你用的什么酶切体系？...

酶切Buffer为Tris-HCl，PH8.0，10mM CaCl2
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9楼2015-03-26 21:00:06
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