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michacel1217

银虫 (小有名气)

[求助] 求助肠激酶酶切融合蛋白 已有1人参与

现在在做一个融合蛋白(序列,表达都正确),带有肠激酶位点,位于两个蛋白中间,想经肠激酶切割后获得肠激酶后面的蛋白,试了不同的反应体系(融合蛋白过量、酶过量都尝试过,看到有的文献Buffer里加有Tween,也都试过,始终切割不下来),做考染始终无法看出,其中,肠激酶已证明有活性。后来我将融合蛋白煮沸10min,再做酶切,可以看见在预期大小的位置有一条微弱的带,但是因为煮沸后蛋白肯定变性,无法用于后期的细胞实验,所以煮沸方法不可取。故想请教各位大神,有什么好的办法或者思路,望大家帮忙指点,不胜感激。
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luliangwmll

新虫 (初入文坛)

亲,你的融合蛋白有3c酶酶切位点吗?如果有我们可以免费给你提供些3C酶的试用装,柱上切或者溶液体系切都没问题。
5楼2015-03-10 23:09:08
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匿名

本帖仅楼主可见
2楼2015-03-10 13:40:02
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michacel1217

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 立林258369 at 2015-03-10 13:40:02
我做融合表达蛋白,用凝血酶来切掉gst
标签,你是在柱子上切的吗?

不是,我是将融合蛋白纯化冻干后重新溶解,再使用肠激酶酶切。
3楼2015-03-10 16:49:43
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luliangwmll

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
为什么要冻干后重新溶解,肠激酶还是很好切的。你要看看你的肠激酶来源是否可靠,酶切buffer是否正确。
4楼2015-03-10 23:07:30
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