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lofty23

禁虫 (正式写手)
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【分子生物】EPI帖 蛋白质生物学实验经验

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1楼 2011-05-01 10:20:55
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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2楼2011-05-01 11:08:43
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314300420

捐助贵宾 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+4): 不错 学习 2011-05-01 14:30:51
西瓜(金币+1, EPI+1): 昨天漏了，补上 2011-05-02 08:41:05
lofty23(金币+1): 2011-05-02 13:26:28
给你一个转缓的配方
Tris  3.029g
Glycine  14.4g
SDS   0.1g
甲醇200ml
总体积1L
25KD的蛋白，300mA转膜30~40min即可。
另外要注意你所用膜的质量，有时候转不上可能是膜过期了，PVDF膜需要先用甲醇活化后再使用。GOOD  LUCK!
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3楼2011-05-01 11:27:28
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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4楼2011-05-01 12:07:28
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
1949stone(金币+4): 都是高手啊 2011-05-01 14:31:10
西瓜: 鼓励交流 2011-05-02 00:37:55
西瓜(金币+1, EPI+1): 2011-05-02 00:38:28
lofty23(金币+1): 2011-05-02 13:26:24
引用回帖:
Originally posted by lofty23 at 2011-05-01 12:07:28:
谢谢！PVDF膜式可以用的，我们的内参的转上了的！

12%的胶。
PVDF 膜的的孔径是0.22 um。
转移缓冲液的配方：
甘氨酸：2.9g
TRIS:5.8g
SDS:0.37g
甲醇：200ml
定容至1L。
60v转移2h。
祝你成功，我们配方很好用的。
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5楼2011-05-01 12:32:45
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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6楼2011-05-01 13:05:39
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-05-02 00:36:33
0.45的可以，不过小蛋白尽量还是不要加入SDS
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7楼2011-05-01 22:56:29
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
lofty23(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by elvias at 2011-05-01 22:56:29:
0.45的可以，不过小蛋白尽量还是不要加入SDS

为什么呢？呵呵~我想学习下，请赐教哦~
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8楼2011-05-02 00:37:03
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雪山飞狐7233

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 热心啊，价格都给了 2011-05-02 12:55:14
引用回帖:
Originally posted by lofty23 at 2011-05-01 13:05:39:
用0.45的膜可以吗？我现在没有0.22的膜!

用0.45的膜肯定转不上去，我有亲身经历，0.22的milipore的PVDF膜很好用的。每卷大约2000元左右。试试吧。
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9楼2011-05-02 08:16:54
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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10楼2011-05-02 09:30:44
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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11楼2011-05-02 09:31:18
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忘忧草1

银虫 (小有名气)
★
lofty23(金币+1):谢谢参与
我们都要用SDS的呀
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12楼2011-05-02 10:11:13
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+6): good，继续加油哦 2011-05-02 11:01:03
lofty23(金币+1): 2011-05-02 13:25:17
12%的胶。
PVDF 膜的的孔径是0.45 um。
转移缓冲液的配方：
Tris  3.029g
Glycine  14.4g
甲醇200ml
定容至1L。
100mA(40V左右)转移1h。
我的蛋白是19KD的，可以做出可重复的结果。
另外，SDS等去垢剂影响膜和蛋白的结合，抵消掉一部分甲醇固定的作用。
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13楼2011-05-02 10:31:38
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elvias

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-05-02 12:26:47
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-02 00:37:03:
为什么呢？呵呵~我想学习下，请赐教哦~

SDS等去垢剂影响膜和蛋白的结合，抵消掉一部分甲醇固定的作用。
所以小分子量的蛋白尽量不要引入SDS，大分子量的倒是没有太大关系。
反正我就是这么弄得，我用0.44的膜可以做10几kD的蛋白。
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14楼2011-05-02 10:34:08
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liang8887

至尊木虫 (文坛精英)
★
lofty23(金币+1):谢谢参与
祝好运！
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15楼2011-05-02 10:43:41
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tigertang

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+5): 欢迎交流 2011-05-02 12:26:34
lofty23(金币+1): 2011-05-02 13:39:13
25kd
最好跑12%的胶
转膜液没有必要加SDS
PVDF和NC膜都行（只是pvdf一定要甲醇处理）
0.22 和0.45 在这没有太大区别
转膜90v 1h足够（冰浴）
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16楼2011-05-02 11:37:45
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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17楼2011-05-02 13:24:59
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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18楼2011-05-02 13:25:54
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viacould

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-05-03 00:41:04
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19楼2011-05-02 16:48:04
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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20楼2011-05-02 23:00:58
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noah1020

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
lofty23(金币+1):谢谢参与
lofty23(金币+1): 2011-05-14 07:48:01
西瓜(金币+3): 补上~鼓励！ 2011-05-14 07:50:11
楼主你用的系统貌似和我的一样~我的分子量是30kD，之前我用恒压法转过，貌似有些会转过头~现在一直是200mA转膜1.5h~转膜的时候一定要把槽子里的冰盒加上，还有最好在外面放一盆冰，把槽子放在冰中~这样可以降低转膜过程中产热造成的蛋白降解~ 你转完膜可以试试用丽春红染色，10min，应该可以出现蛋白条带的，然后再洗洗接着blocking和后续孵育抗体就行~
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21楼2011-05-13 13:09:48
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lofty23

禁虫 (正式写手)
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22楼2011-05-14 07:48:22
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江心洲

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
lz那个你们考马斯亮蓝的配方是多少？我是新手 老是做不出来啊 急
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23楼2013-06-04 09:25:05
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