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lichonglx

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】胞内表达的EGFP想做western-blot

如题，想做个western-blot看看到底有没有EGFP表达，有谁做过的传授下具体方法啊，例如破细胞方法、抗体选择之类的都行，以前没做过western-blot问的不清楚还请见谅，大家明白意思就行了，速回，谢谢了
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1楼 2010-12-10 09:44:05
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yinsongna

金虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-10 14:39:37
照个荧光不就看到EGFP是否表达了吗
用细胞刮刀直接把细胞挂下来，加细胞裂解液（可以买，也可以自己配，分子克隆上都有），加loading buffer 煮蛋白，蛋白电泳，转膜，封闭，加一抗二抗，曝光。。。大概的流程就是这样，你可以看下分子克隆，书上都写的有
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2楼2010-12-10 11:20:48
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lichonglx

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-12-10 11:20:48:
照个荧光不就看到EGFP是否表达了吗
用细胞刮刀直接把细胞挂下来，加细胞裂解液（可以买，也可以自己配，分子克隆上都有），加loading buffer 煮蛋白，蛋白电泳，转膜，封闭，加一抗二抗，曝光。。。大概的流程就 ...

我想证明是荧光蛋白在发光，所以要买单抗和二抗，我是想问问有没有对应EGFP的的抗体，还是用GFP的
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3楼2010-12-10 22:27:58
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小龙sailor

铜虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2010-12-11 08:45:47
挂细胞的方法有点麻烦 ， 我推荐先用胰酶消化然后加培养基中和然后离心去上清，直接加1×sds裂解 99℃10min 样品-80℃保存就好了
wstern blot 像GFP这样的蛋白抗体特异性和好的  一般的就行了
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4楼2010-12-10 22:54:40
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Zedone

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
同学，你好，请问你的EGFP现在表达成功了么，能够成功产生荧光么？我现在急需要一个egfp的表达质粒，不知道您能不能帮帮忙呢？
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5楼2012-12-28 11:14:40
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djyqlzky

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
790355楼: Originally posted by lichonglx at 2010-12-10 22:27:58
我想证明是荧光蛋白在发光，所以要买单抗和二抗，我是想问问有没有对应EGFP的的抗体，还是用GFP的...

不是很明白啊，有荧光不就是EGFP发的荧光吗，难道里面还有其它蛋白发绿荧光？
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6楼2012-12-28 14:48:52
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