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lichonglx

金虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】胞内表达的EGFP想做western-blot

如题,想做个western-blot看看到底有没有EGFP表达,有谁做过的传授下具体方法啊,例如破细胞方法、抗体选择之类的都行,以前没做过western-blot问的不清楚还请见谅,大家明白意思就行了,速回,谢谢了
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lichonglx

金虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by yinsongna at 2010-12-10 11:20:48:
照个荧光不就看到EGFP是否表达了吗
用细胞刮刀直接把细胞挂下来,加细胞裂解液(可以买,也可以自己配,分子克隆上都有),加loading buffer 煮蛋白,蛋白电泳,转膜,封闭,加一抗二抗,曝光。。。大概的流程就 ...

我想证明是荧光蛋白在发光,所以要买单抗和二抗,我是想问问有没有对应EGFP的的抗体,还是用GFP的
3楼2010-12-10 22:27:58
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yinsongna

金虫 (正式写手)


★
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-10 14:39:37
照个荧光不就看到EGFP是否表达了吗
用细胞刮刀直接把细胞挂下来,加细胞裂解液(可以买,也可以自己配,分子克隆上都有),加loading buffer 煮蛋白,蛋白电泳,转膜,封闭,加一抗二抗,曝光。。。大概的流程就是这样,你可以看下分子克隆,书上都写的有
2楼2010-12-10 11:20:48
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小龙sailor

铜虫 (小有名气)


★ ★
dhd997(金币+2):good 2010-12-11 08:45:47
挂细胞的方法有点麻烦 , 我推荐先用胰酶消化然后加培养基中和然后离心去上清,直接加1×sds裂解 99℃10min 样品-80℃保存就好了
wstern blot 像GFP这样的蛋白抗体特异性和好的  一般的就行了
4楼2010-12-10 22:54:40
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Zedone

木虫 (正式写手)


★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
同学,你好,请问你的EGFP现在表达成功了么,能够成功产生荧光么?我现在急需要一个egfp的表达质粒,不知道您能不能帮帮忙呢?
5楼2012-12-28 11:14:40
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