应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助
141/2返回列表12下一页
查看: 1574  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

lliuzhi

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR求助 已有9人参与

本人做的是普通PCR，刚开始做一直有目的产物，用的是生工的Taq酶，但是总会出现阶段性没有产物的情况，甚至都没有非特异性产物和引物二聚体。之前怀疑是酶出了问题或者是模板降解了，但是经检测后模板没有问题，也换了Taq、 TAKARA的Extaq、rtaq、生工的Pfu、可是仍旧没有产物，后来偶然用同样的东西又能P出来了，但是很不稳定，过几天又没有了，请问高手是什么问题呢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-03-17 08:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
每次做3个平行，减少偶然因素
赞一下(1人) 回复此楼
小木虫之有关部门负责人
2楼2011-03-17 09:12:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xwsooo

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2): 有道理 2011-03-17 10:52:22
检查实验记录，何时做出来，何时又没有；还有，加样时要准确，特别在微量情况下，误差容易变大。这是我的一点体会。还有，可能就是体系还不完善，才会出现如此貌似怪异的事件。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2011-03-17 10:26:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘在海上的雪

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第一次做不出来的时候，二次PCR，我有的甚至做过三次PCR,能出结果
赞一下(1人) 回复此楼
不在沉默中爆发，就在沉默着死亡！
4楼2011-03-17 10:40:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Allanflying

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
影响因素会很多，PCR仪有时候还抽疯呢
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-03-17 11:25:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+2): 鼓励 2011-03-17 13:09:24
首先怀疑你的反应体系可能不完善，造成了不稳定，这应该是最主要的原因，当然前提是你的模板、引物和酶没有问题。建议你做梯度PCR优化一下体系，另外向上面朋友说的一样，要考虑偶然因素。
赞一下(2人) 回复此楼
6楼2011-03-17 11:59:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lliuzhi

金虫 (正式写手)
谢谢大家
回复此楼
7楼2011-03-18 15:57:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangby2002

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lliuzhi at 2011-03-17 08:53:50:
本人做的是普通PCR，刚开始做一直有目的产物，用的是生工的Taq酶，但是总会出现阶段性没有产物的情况，甚至都没有非特异性产物和引物二聚体。之前怀疑是酶出了问题或者是模板降解了，但是经检测后模板没有问题，也 ...

假如引物没问题的话，优化PCR体系，加大模板量以及循环数~试试看！
赞一下(1人) 回复此楼
业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
8楼2011-03-19 16:41:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我认为这问题的原因很多！
1. 程序问题，请确定PCR仪器和设定的程序；
I. 变性温度足够，对于基因组95度5min可以了，以菌液为模板的话，阴性菌可以延长5min，而阳性菌则可以延长到15min，不比担心聚合酶变性；
II. 退火温度，第一次做的话，可以设定一个梯度，退火50-65度的温度梯度，这个范围30S时间对于引物都可以与模板结合；
III. 延伸温度，taq酶-1.0K/min，pfu酶-0.5K/min；各个公司的常规聚合酶的差别主要在保证性和延伸速度上，大多数都差别不大，没别要频繁更换聚合酶；

2. 引物问题
  请再次分析下你的序列，是否和你要扩增的基因匹配，并且预测下它们的Tm值，请不要低于55度，我个人常用的Tm值一般在58-62度之间；

3. 对于上面提到的加样问题，在实验操作时，也要注意小心加样，聚合酶太多的话，对反应是有抑制作用的，根据每种聚合酶自己的说明书参考设计反应体系即可。

以上是个人的一些经验，楼主如果有什么问题，可以随时和我联系。祝你成功。
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2011-03-19 17:05:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lliuzhi

金虫 (正式写手)
谢谢大家的帮助。
回复此楼
10楼2011-03-20 08:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 lliuzhi 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 070300，一志愿北航320求调剂 +3 Jerry0216 2026-03-22 5/250 2026-03-23 09:16 by 。。堂堂
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +6 生物工程调剂 2026-03-17 10/500 2026-03-22 20:22 by edmund7
[考研] 315分，诚求调剂，材料与化工085600 +3 13756423260 2026-03-22 3/150 2026-03-22 20:11 by edmund7
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 285求调剂 +6 ytter 2026-03-22 6/300 2026-03-22 12:09 by 星空星月
[考研] 材料求调剂 +5 @taotao 2026-03-21 5/250 2026-03-21 20:55 by lbsjt
[考研] 考研调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
[考研] 工科0856求调剂 +3 沐析汀汀 2026-03-21 3/150 2026-03-21 18:30 by 学员8dgXkO
[考研] 304求调剂 +6 曼殊2266 2026-03-18 6/300 2026-03-21 00:32 by JourneyLucky
[考研] 一志愿中海洋材料工程专硕330分求调剂 +8 小材化本科 2026-03-18 8/400 2026-03-20 23:16 by JourneyLucky
[考研] 一志愿南京理工大学085701资源与环境302分求调剂 +4 葵梓卫队 2026-03-18 6/300 2026-03-20 23:02 by JourneyLucky
[考研] 中南大学化学学硕337求调剂 +3 niko- 2026-03-19 6/300 2026-03-20 21:58 by luoyongfeng
[考研] 295复试调剂 +8 简木ChuFront 2026-03-19 8/400 2026-03-20 20:44 by zhukairuo
[考研] 一志愿吉林大学材料学硕321求调剂 +11 Ymlll 2026-03-18 15/750 2026-03-20 19:40 by 丁丁*
[考研] 320求调剂0856 +3 不想起名字112 2026-03-19 3/150 2026-03-19 22:53 by 学员8dgXkO
[考研] 0703化学调剂 +4 18889395102 2026-03-18 4/200 2026-03-19 16:13 by 30660438
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 本科郑州大学物理学院，一志愿华科070200学硕，346求调剂 +4 我不是一根葱 2026-03-18 4/200 2026-03-19 09:11 by 浮云166
[考研] 材料工程专硕调剂 +5 204818@lcx 2026-03-17 6/300 2026-03-18 22:55 by 204818@lcx
[考博] 26博士申请 +3 1042136743 2026-03-17 3/150 2026-03-17 23:30 by 轻松不少随
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭