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lliuzhi

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】PCR求助已有9人参与

本人做的是普通PCR，刚开始做一直有目的产物，用的是生工的Taq酶，但是总会出现阶段性没有产物的情况，甚至都没有非特异性产物和引物二聚体。之前怀疑是酶出了问题或者是模板降解了，但是经检测后模板没有问题，也换了Taq、 TAKARA的Extaq、rtaq、生工的Pfu、可是仍旧没有产物，后来偶然用同样的东西又能P出来了，但是很不稳定，过几天又没有了，请问高手是什么问题呢

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1楼 2011-03-17 08:53:50

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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓

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性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

我认为这问题的原因很多！
1. 程序问题，请确定PCR仪器和设定的程序；
I. 变性温度足够，对于基因组95度5min可以了，以菌液为模板的话，阴性菌可以延长5min，而阳性菌则可以延长到15min，不比担心聚合酶变性；
II. 退火温度，第一次做的话，可以设定一个梯度，退火50-65度的温度梯度，这个范围30S时间对于引物都可以与模板结合；
III. 延伸温度，taq酶-1.0K/min，pfu酶-0.5K/min；各个公司的常规聚合酶的差别主要在保证性和延伸速度上，大多数都差别不大，没别要频繁更换聚合酶；

2. 引物问题
请再次分析下你的序列，是否和你要扩增的基因匹配，并且预测下它们的Tm值，请不要低于55度，我个人常用的Tm值一般在58-62度之间；

3. 对于上面提到的加样问题，在实验操作时，也要注意小心加样，聚合酶太多的话，对反应是有抑制作用的，根据每种聚合酶自己的说明书参考设计反应体系即可。

以上是个人的一些经验，楼主如果有什么问题，可以随时和我联系。祝你成功。

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