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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助
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lliuzhi

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR求助 已有9人参与

本人做的是普通PCR，刚开始做一直有目的产物，用的是生工的Taq酶，但是总会出现阶段性没有产物的情况，甚至都没有非特异性产物和引物二聚体。之前怀疑是酶出了问题或者是模板降解了，但是经检测后模板没有问题，也换了Taq、 TAKARA的Extaq、rtaq、生工的Pfu、可是仍旧没有产物，后来偶然用同样的东西又能P出来了，但是很不稳定，过几天又没有了，请问高手是什么问题呢
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1楼 2011-03-17 08:53:50
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
每次做3个平行，减少偶然因素
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小木虫之有关部门负责人
2楼2011-03-17 09:12:44
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xwsooo

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+2): 有道理 2011-03-17 10:52:22
检查实验记录，何时做出来，何时又没有；还有，加样时要准确，特别在微量情况下，误差容易变大。这是我的一点体会。还有，可能就是体系还不完善，才会出现如此貌似怪异的事件。
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3楼2011-03-17 10:26:09
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飘在海上的雪

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
第一次做不出来的时候，二次PCR，我有的甚至做过三次PCR,能出结果
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不在沉默中爆发，就在沉默着死亡！
4楼2011-03-17 10:40:58
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Allanflying

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
影响因素会很多，PCR仪有时候还抽疯呢
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5楼2011-03-17 11:25:18
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
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看天(金币+2): 鼓励 2011-03-17 13:09:24
首先怀疑你的反应体系可能不完善，造成了不稳定，这应该是最主要的原因，当然前提是你的模板、引物和酶没有问题。建议你做梯度PCR优化一下体系，另外向上面朋友说的一样，要考虑偶然因素。
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6楼2011-03-17 11:59:36
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lliuzhi

金虫 (正式写手)
谢谢大家
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7楼2011-03-18 15:57:45
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zhangby2002

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by lliuzhi at 2011-03-17 08:53:50:
本人做的是普通PCR，刚开始做一直有目的产物，用的是生工的Taq酶，但是总会出现阶段性没有产物的情况，甚至都没有非特异性产物和引物二聚体。之前怀疑是酶出了问题或者是模板降解了，但是经检测后模板没有问题，也 ...

假如引物没问题的话，优化PCR体系，加大模板量以及循环数~试试看！
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
8楼2011-03-19 16:41:42
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bioartist

木虫 (正式写手)

无菌草莓
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我认为这问题的原因很多！
1. 程序问题，请确定PCR仪器和设定的程序；
I. 变性温度足够，对于基因组95度5min可以了，以菌液为模板的话，阴性菌可以延长5min，而阳性菌则可以延长到15min，不比担心聚合酶变性；
II. 退火温度，第一次做的话，可以设定一个梯度，退火50-65度的温度梯度，这个范围30S时间对于引物都可以与模板结合；
III. 延伸温度，taq酶-1.0K/min，pfu酶-0.5K/min；各个公司的常规聚合酶的差别主要在保证性和延伸速度上，大多数都差别不大，没别要频繁更换聚合酶；

2. 引物问题
  请再次分析下你的序列，是否和你要扩增的基因匹配，并且预测下它们的Tm值，请不要低于55度，我个人常用的Tm值一般在58-62度之间；

3. 对于上面提到的加样问题，在实验操作时，也要注意小心加样，聚合酶太多的话，对反应是有抑制作用的，根据每种聚合酶自己的说明书参考设计反应体系即可。

以上是个人的一些经验，楼主如果有什么问题，可以随时和我联系。祝你成功。
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9楼2011-03-19 17:05:49
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lliuzhi

金虫 (正式写手)
谢谢大家的帮助。
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10楼2011-03-20 08:19:57
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