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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR后的cDNA呢？
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tingl0087

金虫 (小有名气)

[交流] RT-PCR后的cDNA呢？ 已有5人参与

今天做真菌RT-PCR合成cDNA第一链，但是却出现下图结果，我的目的RNA应是1000多bp，请做过的虫子帮忙分析下原因。marker是DL2000，最右面是RNA，中间两道分别是用oligo（dT）和随机引物作引物的结果。

[ Last edited by amisking on 2010-5-10 at 18:18 ]
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1楼 2009-08-11 21:02:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
tingl0087(金币+1,VIP+0):那这种情况我应该继续往下做吗？ 8-11 22:09
总cDNA本来就是一片smear的……
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2楼2009-08-11 21:37:31
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
这种情况才是正常的~~~
我现在都不跑cDNA电泳，逆转录之后直接PCR
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3楼2009-08-11 22:14:15
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pigsunny

铜虫 (小有名气)
我都不跑cDNA电泳，逆转录之后直接PCR
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学习成就未来！
4楼2009-08-11 23:21:33
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
★
tingl0087(金币+1,VIP+0):谢谢！恍然大悟~ 8-12 23:19
这样跑胶没有意义，你看到的其实是降解的RNA， EB只能和双链DNA结合，不能和单链cDNA结合。就算结合你也看不到条带，cDNA的大小不等，你想看到多大的呢？
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5楼2009-08-11 23:35:25
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★
tingl0087(金币+1,VIP+0):哦，谢谢！ 8-12 23:28
EB和单链DNA的结合能力较弱并非无法结合
或者说，单链DNA的行程的局部双链数不如等长双链的多
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6楼2009-08-11 23:38:23
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蓝皮鼠7983

至尊木虫 (文坛精英)

飞过蓝天
帮顶
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海到尽头天做岸，山登绝顶我为峰。
7楼2009-08-12 00:42:38
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wangqk198738

金虫 (正式写手)

绝对有问题！

★
tingl0087(金币+1,VIP+0):我查过文献真核生物RNA是有3条带的啊。。。 8-12 23:23
不管怎么说，如果你提取的是总RNA那就是你自己的设计程序有问题了，你自己想想啊，总RNA在跑样的时候是不是两条带，很显然的，你的最右边的是三条带，怎么可能呢，我也出现过类似的情况，但后来就没有了，。此外我实在不敢恭维你的照相技术，曝光这么差，调一下就很好的，也不至于你的另外两条带看不清楚。
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8楼2009-08-12 07:58:09
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panacea007

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
tingl0087(金币+2,VIP+0):谢谢！ 8-12 23:25
tingl0087(金币+2,VIP+0):今天直接RT后做了PCR，可是只有引物二聚体，照你的经验，可能是什么原因呢？再谢谢了！ 8-12 23:32
引用回帖:
Originally posted by wangqk198738 at 2009-8-12 07:58:
不管怎么说，如果你提取的是总RNA那就是你自己的设计程序有问题了，你自己想想啊，总RNA在跑样的时候是不是两条带，很显然的，你的最右边的是三条带，怎么可能呢，我也出现过类似的情况，但后来就没有了，。此外我 ...

真菌这类真核生物，如果用Trizol提RNA，本来就应该有3条带吧，5.8S， 18 S， 28 S RNA，没有错。

cDNA基本上电泳看不出条带的，就是smear，楼主不用电泳了，直接逆转录，没有问题。cDNA的量本来就少，加上是单链，看不出自己目的条带的。18S，28S RNA 能看到，是因为它的浓度非常大，有比较均一，一样的大小。
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9楼2009-08-12 11:19:19
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anik

银虫 (正式写手)
正常现象。
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10楼2009-08-12 14:51:01
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