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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » T4连接酶反应体系
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xms0422

铁虫 (小有名气)

[求助] T4连接酶反应体系

要做酶连了，实验室买了takara的T4连接酶，但是说明书上并没有反应条件和体系，求助各位大神，反应温度和体系应该是怎样比较合适？

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1楼 2016-11-21 07:00:49
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xms0422

铁虫 (小有名气)
用的是Ncol 和Xhol两个酶切的

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2楼2016-11-21 07:02:44
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
我们连接体系10微升    1微升buffer  0.5微升酶   载体片段一般1比10   16度过夜连接

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3楼2016-11-21 08:36:55
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huhao0230

金虫 (初入文坛)
一般载体和片段的总浓度是1-10ng/ul，片段和载体的摩尔浓度比是2-6之间
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4楼2016-11-21 10:38:19
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xms0422

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 迷路人啊 at 2016-11-21 08:36:55
我们连接体系10微升    1微升buffer  0.5微升酶   载体片段一般1比10   16度过夜连接

请问连接后需要65度孵育10分钟再转入感受态吗？

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5楼2016-11-23 08:44:24
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xms0422 at 2016-11-23 08:44:24
请问连接后需要65度孵育10分钟再转入感受态吗？
...

我没这么干过

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6楼2016-11-23 09:15:52
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xms0422

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 迷路人啊 at 2016-11-21 08:36:55
我们连接体系10微升    1微升buffer  0.5微升酶   载体片段一般1比10   16度过夜连接

片段有3000bp  是否很难插进去？

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7楼2016-11-27 12:53:34
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xms0422 at 2016-11-27 12:53:34
片段有3000bp  是否很难插进去？
...

还好吧    看你载体的负载能到多大

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8楼2016-11-27 12:58:55
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guaidiandian

新虫 (小有名气)
总共10微升体系  酶切后的目的片段回收后分别加2 3 4 5 6相应的酶切载体加6 5 4 3 2然后1微升 buffer1微升酶  有时候做中间三组就完全可以得到想要的结果了  然后放冰箱4度链接24小时后做转化就行

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9楼2016-11-27 23:15:13
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