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lvye3707

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[求助] pbi121 植物表达载体构建，连接后不长菌落

我将含酶切位点的目的片段（1500bp左右）放在pmd18 T载体（Takara）里，用Sac I和Xba I 酶切（这两种酶都是Takara 快速内切酶），50ul酶切体系：
Xba I 2ul；
Sac I 1ul；
Buffer 5ul；
DNA 5ul;
水37ul
酶切2h，70℃15min后，胶回收；
用T4DNA连接酶连接，10ul连接体系：
T4 连接酶 1ul；
buffer 2.5ul；
DNA片段 3ul；
载体3ul；
水 0.5ul；
转化时冰浴30min，42℃ 90s，冰浴2min，LB液体培养基 37℃ 摇至浑浊，涂板 50ug/ml Km抗性，12个小时后不长菌落，做了很多次了，可就是不长菌这是什么情况呢？
照片是含正义/反应的T载体，pbi121载体酶切的情况和回收的情况，里面的是酶切的和原始质粒的对比

正，反酶切.jpg

P载体酶切 .jpg

P载体酶切 .jpg

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1楼 2013-01-21 11:25:43

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yesali

木虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lvye3707: 金币+5, ★有帮助, 我的酶切的彻底么？ 2013-01-21 13:04:39
amisking: 回帖置顶 2013-01-21 20:20:48
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2013-01-21 20:20:55

这个问题，确实是很郁闷，以前我也遇到过，做了好多次，就是不长菌，
最后交给隔壁实验室的一个同学，他给我做了一次就成了，，用他的话来说“人品问题”。
楼主也可以交给同学做一下，
很简单的实验，有时候就是邪门了