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关于NEB和TAKARA的T4多聚核苷酸磷酸化效率问题，困扰许久了，谢谢 已有1人参与
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关于T4多聚核苷酸磷酸化问题 我用的贵公司的相关说明书：放射性标记反应：50 μl 反应体系中用(1× T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer、50 pmol γ-[32P] ATP)，加入20单位的酶可催化1-50 pmol的5'末端。 非放射性磷酸化反应：在50 μl 反应体系中用1×T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer、1 mM ATP和10单位的酶37°C温育30分钟能催化300 pmol的5'末端磷酶化。含1 mM ATP的1×T4 DNA连接酶缓冲液在非放射性磷酸化反应中可以代替1×T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer应用，在此缓冲液中T4多聚核苷酸激酶也可以有100%的活力。 这是TAKARA的说明书： 磷酸化标记5′末端的反应 dephosphorylated oligonucleotide 1-50 pmol 10×T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer 5 μl 111-185 TBq/mmol [γ-32P]ATP 0.37-3.7 MBq (3000-5000 Ci/mmol) (10-100 μCi) T4 Polynucleotide Kinase 5-20 units dH2O up to 50 μl 37℃下反应30分钟。 上述方法适用于使用平末端或3’突出末端的寡核苷酸，但标记效率可能比使用单链核苷酸或5’末端突出末端的核苷酸低。 进行非标记的磷酸化反应时，请在反应液中加入终浓度1 mM的ATP来代替[γ-32P]ATP。 这两个反应体系在放射性标记的磷酸化的反应体系是一样的，你们的酶定义还有buffer都是一样的，为什么在非放射性的磷酸化标记的体系差距这么大，贵公司推荐10 U反应300pmol的末端，但是TAKARA没有明说，可能是按照放射性标记的一样，能不能解释下呢？谢谢！另外放射性标记的效率是不是不非放射性的标记低呢？非常感谢 |
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看了一眼Takara的T4 PNK说明书，这家公司也忒奇怪了点，只有同位素标记的体系 T4 PNK单位定义倒是跟其他公司差不多，也是30min 1nmol ATP掺入。 一般这个酶用得很随意的，终浓度1mM的ATP能保证就可以了，你可以参考NEB的体系，如果非要一个心理安慰的话。 另外，我觉得T4PNK标记的体系不适合DNA annealing，你可以查一下annealing buffer，且不谈pH，DNA annealing buffer肯定是一个一价盐浓度比较高的体系，T4 PNk又是一个怕盐的酶，很多公司的T4 PNK系统里面还有亚精胺，这个对annealing也有干扰。所以我觉得这个体系做annealing，效率不是最优化状态。 不管你的DNA多小，酚抽醇沉总是可以工作的。了不起加一点glycogen。 |
7楼2014-04-18 11:09:55
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你注意到了一个现象，但是没有把问题搞清楚。 第一个问题是T4PNK的单位定义，也就是这个酶，1U能干啥。T4PNK的能力是很强的，不管什么公司，1U T4PNK的催化能力都是在nmol级别的，所有多少pmol的产物，不在话下。 第二个问题是体系问题，巧妇难为无米之炊，T4 PNK的催化能力再强，需要的是底物，待标记的DNA是一个方面，而ATP浓度也是一个方面。 再回到你疑问的问题，同位素标记时，为什么说T4PNK的标记活性看着就低一些呢？ γ-32P-ATP分为强度和浓度两个指标，一般而言，最高的也就是6000Ci/mol，10mCi/mL，浓度是1.67μM，所以即便加10μL，20μL的体系ATP总浓度也不过0.835 μM。一般而言，T4PNK的ATP最低要求1 μM，这还达不到，何况没有人加这么多同位素做标记，这个信号强得要死。 但是非同位素标记的时候，ATP一般都是给到1mM的，这也是T4PNK活性定义的时候使用的浓度。 所以你明白没？ |
2楼2014-04-18 09:35:26
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我还想问下，根据酶活定义体系（酶活10 U/ul） 我做的是正常的磷酸化，不需要标记的 TAKARA说明书上的体系： dephosphorylated oligonucleotide 1-50 pmol 10×T4 DNA Polynucleotide Kinase Buffer 5 μl 111-185 TBq/mmol [γ-32P]ATP 0.37-3.7 MBq (3000-5000 Ci/mmol) (10-100 μCi) T4 Polynucleotide Kinase 5-20 units dH2O up to 50 μl 37℃下反应30分钟。 我根据酶活定义调整的体系： 10×T4 polynucletide Kinase Buffer 2 ul Dephosphorylated oligonucleotide 1200 pmol 5’OH末端（互补单链DNA各600 pmol，） （终浓度） ATP （ 终浓度） ATP 1 mM（20000 pmol） T4 polynucleotide Kinase 40 U dd H2O up to 20 ul 我是为了加大我的反应体系中的DNA的浓度，所以缩小体系的，因为后续试验会被稀释。不知道这样调整可以不？如果按照单链oligonucleotide与ATP 1:1进行的话，ATP的量是单链DNA的 17倍了，应该是足够的，关键是我的小片段不好电泳检查，而且还是好几种的片段的连接，所以前面磷酸化片段的浓度要很高才行!不知道这样可行不？另外我想磷酸化之后直接退火成双链，不知道可以不？谢谢 |
3楼2014-04-18 09:59:53
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这是说明书，同样都是T4多聚核苷酸激酶，来源和buffer都一样，但是体系差距太大了，不知道怎么回事？我觉得NEB的更可靠，我现在买的是TAKARA的产品，谢谢前辈 |
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2014-04-18 10:03:55, 32 K
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4楼2014-04-18 10:05:28
西门吹雪170
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liuyil5楼2014-04-18 10:16:09
6楼2014-04-18 10:19:57
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但是一般公司给的体系就是一定能做出来，酶这些肯定是超过量的，而且在高的ATP浓度下，磷酸化反应还是能高效率进行的，所以我自己调整的那个体系您觉得怎么样，因为我觉得ATP的浓度1mM条件下，完全能反应完全。 10×T4 polynucletide Kinase Buffer 2 ul Dephosphorylated oligonucleotide 1200 pmol 5’OH末端（互补单链DNA各600 pmol，） （终浓度） ATP （ 终浓度） ATP 1 mM（20000 pmol） T4 polynucleotide Kinase 40 U（可催化40 nmol的ATP，即40000 pmol的ATP的P的转移） dd H2O up to 20 ul 你觉得能行吗？另外我认为退火只要溶液中保证了一定的离子强度就很容易进行，我之前看很多人的帖子说在水中都可以退火，我觉得u可行。我准备磷酸化之后，直接放在94 度的金属浴中，关闭电源，自然降温。 |
8楼2014-04-18 11:32:32
9楼2014-04-21 09:27:53
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