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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白不表达,该怎么办? 已有1人参与

按照正常的顺序,扩增基因,酶切,连接到pet28a里,转化到DH5a中,测序正确,再提取质粒转化到表达菌株中,可是做了几次蛋白都不表达啊,求蛋白表达的高手指导呀!图中最后一个是pet28a,完全是一点特异性都没有!

蛋白不表达,该怎么办?


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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

改变一下诱导条件,温度,加诱导剂时的OD值,诱导时间等等,我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有,那就换载体吧,最简单暴力的办法

你可以看一下那些表达不出来的最后是怎么解决问题的

我之前用的两个载体也是不出,pet22b和pet30a,后来换了pet32a马上出了,诱导条件参数连调都不用调
除了pet32a,还有一个比较好用的就是pgex系列的,学院同学之间要一下吧
2楼2016-03-08 09:37:19
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nannanz2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
诱导条件可以优化下,另外可以换一下载体,载体很重要
3楼2016-03-08 11:08:45
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向日21

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sdjnyxn123 at 2016-03-08 09:37:19
改变一下诱导条件,温度,加诱导剂时的OD值,诱导时间等等,我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有,那就换载体吧,最简单暴力的办法

你可以看一下那些 ...

好的,谢谢,我分析过我的序列,不存在稀有密码子的问题。我用的bl21不表达,又用了rossta ,还是不表达。现在想换一下pet32a。我用的ecor1和Hindiii两个酶切位点,当初做连接就用了三个月,好害怕换载体呀!新手,做实验太难了!

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4楼2016-03-08 11:18:18
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向日21

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sdjnyxn123 at 2016-03-08 09:37:19
改变一下诱导条件,温度,加诱导剂时的OD值,诱导时间等等,我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有,那就换载体吧,最简单暴力的办法

你可以看一下那些 ...

还有,我的目的片段有2500bp,蛋白有90KD,我一直害怕它不表达

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5楼2016-03-08 11:21:23
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 向日21 at 2016-03-08 11:21:23
还有,我的目的片段有2500bp,蛋白有90KD,我一直害怕它不表达
...

啊,pet32a融合蛋白本身就挺大的了,好像是有20kD了吧
6楼2016-03-08 15:09:11
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