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落泪天使

新虫 (初入文坛)

[求助] 体外蛋白纯化

我的基因原核表达是包涵体的形式存在的,而我想做蛋白的活性,要纯化蛋白,不知道该怎么办才能使蛋白可溶呢?我的表达载体是pGEX,有人能指导一下吗?



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jiangyhai

金虫 (著名写手)

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感谢参与,应助指数 +1
可以考虑试试SUMO标签载体。
静心做事。
2楼2012-12-05 20:53:31
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-08 07:17:29
可以先用盐酸胍或是尿素变性纯化,然后再复性就行了。
3楼2012-12-06 08:31:29
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议调整一下温度,诱导剂浓度和诱导时间,使其尽可能的减少包涵体
4楼2012-12-06 13:15:21
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-12-08 07:17:15
可以选择换标签,我们用TRX一般都有可溶的。多尝试温度等变化对表达的影响,最好不要用变性复性的方法,一个是难,另一个是没有好的方法进行全面的检测活性恢复。
学习,进步
5楼2012-12-07 08:15:11
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
破壁了萃取不行吗?
6楼2012-12-07 13:15:08
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gaorongbest

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我记得我们师兄当时是用超声破碎来做的,你可以试试行不行,可以在冰上超声,以免细胞活性降低,或者加一点蛋白酶抑制剂,都可以先试试,一般蛋白纯化需要几种方法连用,还有标签的选择等很多问题
为客户提供更好的科研外包服务:如分子、免疫、病理、细胞培养、动物实验等
7楼2012-12-07 15:12:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
除了摸索表达条件外,换载体也是一种方法,同时试一下包涵体复溶。
流星来时我许了个愿,愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具,久不看论坛一来就提问者,宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2012-12-08 01:36:00
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

【答案】应助回帖

1.先处理包涵体,除去一些杂质,用去垢剂EDTA,DTT,脱氧胆酸钠,DNase 1,溶解湿菌体,破菌,收集包涵体
2.变性。8~10M尿素变性
3.复性。比较困难2M尿素,添加一些精氨酸,Tris,EDTA 等
笑对人生,相信自己。
9楼2012-12-14 13:05:16
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wangyoucao52

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

变复性得到的活性蛋白会减少,最好是调整诱导剂浓度,低温诱导等,先少量看看是否有可溶性的产生,还是这样比较省事
10楼2012-12-14 14:27:38
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