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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 体外蛋白纯化
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落泪天使

新虫 (初入文坛)

[求助] 体外蛋白纯化

我的基因原核表达是包涵体的形式存在的，而我想做蛋白的活性，要纯化蛋白，不知道该怎么办才能使蛋白可溶呢？我的表达载体是pGEX，有人能指导一下吗？



非常感谢！
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1楼 2012-12-05 17:34:15
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jiangyhai

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑试试SUMO标签载体。
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静心做事。
2楼2012-12-05 20:53:31
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-12-08 07:17:29
可以先用盐酸胍或是尿素变性纯化，然后再复性就行了。
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3楼2012-12-06 08:31:29
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xj0311

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议调整一下温度，诱导剂浓度和诱导时间，使其尽可能的减少包涵体
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4楼2012-12-06 13:15:21
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生物小通

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-12-08 07:17:15
可以选择换标签，我们用TRX一般都有可溶的。多尝试温度等变化对表达的影响，最好不要用变性复性的方法，一个是难，另一个是没有好的方法进行全面的检测活性恢复。
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学习，进步
5楼2012-12-07 08:15:11
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
破壁了萃取不行吗？
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6楼2012-12-07 13:15:08
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gaorongbest

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我记得我们师兄当时是用超声破碎来做的，你可以试试行不行，可以在冰上超声，以免细胞活性降低，或者加一点蛋白酶抑制剂，都可以先试试，一般蛋白纯化需要几种方法连用，还有标签的选择等很多问题
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为客户提供更好的科研外包服务：如分子、免疫、病理、细胞培养、动物实验等
7楼2012-12-07 15:12:50
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
除了摸索表达条件外，换载体也是一种方法，同时试一下包涵体复溶。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
8楼2012-12-08 01:36:00
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grape114

金虫 (正式写手)

Biosimilars

【答案】应助回帖

1.先处理包涵体，除去一些杂质，用去垢剂EDTA,DTT，脱氧胆酸钠，DNase 1，溶解湿菌体，破菌，收集包涵体
2.变性。8~10M尿素变性
3.复性。比较困难2M尿素，添加一些精氨酸，Tris，EDTA 等
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笑对人生，相信自己。
9楼2012-12-14 13:05:16
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wangyoucao52

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

变复性得到的活性蛋白会减少，最好是调整诱导剂浓度，低温诱导等，先少量看看是否有可溶性的产生，还是这样比较省事
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10楼2012-12-14 14:27:38
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