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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白纯化遇到问题
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白纯化遇到问题

各位虫友，大家好！我最近在做可溶性蛋白的诱导表达，好不容易表达出来，但是纯化的时候没摸好条件，洗脱时没有把杂蛋白去除干净，我还能再将洗脱下来的蛋白重新上柱再洗脱一次吗？
为我用的宿主菌是革兰氏阳性菌，每次超声破碎都很麻烦，要好几个小时，而且我的要求不高，只要能纯化到我的目的蛋白就行。
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1楼2012-09-23 09:09:01
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by ypan at 2012-09-24 13:30:49
用的是什么标签，His还是GST？
一般这两种比较常用，多采用亲和层析的方法。
在之前一般是要用超声波破碎的方法破碎细胞。
我之前是用His标签的，用的是Novagen公司的亲和层析镍柱分离目的蛋白，当然这是5年前的 ...

用的His标签，纯化也用的Novagen公司的镍柱
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13楼2012-09-25 16:44:29
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普通回帖

Jorming033

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
淡竹2066: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-25 16:45:17
电泳之后蛋白一般都已经变性了，不能在层析。但你如果用原始混有杂蛋白的原溶液是可以再次层析纯化的。
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论文命运真多折，希望是好事多磨，祈求好运
2楼2012-09-23 09:16:36
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水凝胶

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:24:22
淡竹2066: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-09-25 16:45:31
可以，我们实验室的可溶性蛋白是过两次柱子，凝胶柱和金属亲和柱，你可以尝试用不同的柱子。你的蛋白好杂最好在上样处理一下，比如说盐析之类的，
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3楼2012-09-23 10:05:02
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小神龙198901

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
淡竹2066: 金币+1, ★有帮助 2012-09-25 16:45:48
可以的，或者你也可以再跑下非变性电泳，应该也是没问题的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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加油你能行
4楼2012-09-23 10:42:08
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小神龙198901 at 2012-09-23 10:42:08
可以的，或者你也可以再跑下非变性电泳，应该也是没问题的

好的，那我先试试，谢谢！
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5楼2012-09-23 11:02:06
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Jorming033 at 2012-09-23 09:16:36
电泳之后蛋白一般都已经变性了，不能在层析。但你如果用原始混有杂蛋白的原溶液是可以再次层析纯化的。

我有电泳之前的原溶液。
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6楼2012-09-23 11:03:38
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 水凝胶 at 2012-09-23 10:05:02
可以，我们实验室的可溶性蛋白是过两次柱子，凝胶柱和金属亲和柱，你可以尝试用不同的柱子。你的蛋白好杂最好在上样处理一下，比如说盐析之类的，

我们实验室就一种亲和柱，我的蛋白是直接从细胞破碎液中纯化得到，之前没有处理过的。
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7楼2012-09-23 11:05:25
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乱舞成影

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-09-24 10:24:35
最主要的先是超声破碎一定要完全 。
上柱子的时候建议金属亲和柱，可能效果好一些。
要不你再做一个透析吧 透析液里加点甘油。。。
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8楼2012-09-23 14:39:08
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青豆同学

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
当然可以，但上柱子前样品要透析换缓冲液，你知道吧
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谢谢你给我信心与力量，我会努力！
9楼2012-09-24 12:19:23
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ypan

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用的是什么标签，His还是GST？
一般这两种比较常用，多采用亲和层析的方法。
在之前一般是要用超声波破碎的方法破碎细胞。
我之前是用His标签的，用的是Novagen公司的亲和层析镍柱分离目的蛋白，当然这是5年前的事情了。
现在蛋白纯化的产品很多。可以找找GE、Qiagen、MN等。
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10楼2012-09-24 13:30:49
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