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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 镍柱纯化蛋白遇到了些问题，蛋白挂不上柱，怎么办？？？？求解
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tianqingzn

新虫 (初入文坛)

[求助] 镍柱纯化蛋白遇到了些问题，蛋白挂不上柱，怎么办？？？？求解 已有1人参与

大肠杆菌重组表达的蛋白，带有his标签（N端和C端各一个），经过超声波破碎取上清，酶活很高，然后用镍柱纯化粗酶液，开始用的结合缓冲液加有咪唑，最后的结果是蛋白没挂柱，因为第一次收的液体酶活很高，最后用洗脱液收的液体没有酶活。后来用不加咪唑的结合缓冲液重新纯化蛋白，结果是挂上少许蛋白，而且最终收的液体测酶活酶活很低，该怎么优化纯化体系？？？？还是因为蛋白的his标签在蛋白里面包裹没有暴漏出来，所以挂不上柱，求解，拜托给位前辈了！！！！
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为梦想奋斗！
1楼 2014-12-18 15:59:17
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lpzl

木虫 (正式写手)
楼主经过超声波破碎取上清，酶活很高？既然有很高的酶活力，干嘛纯化？
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-12-18 16:39:07
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zwk520

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
镍柱纯化的话 注意pH值在6.0以上 否则氮会质子化 7.4挂上柱子没问题。buffer最好用你测酶活的 咪唑可能会有影响 洗脱后透析或脱盐除去咪唑 表达时tag放两端 要还不行在tag与蛋白之间加个linker 可能tag没完全暴露

[ 发自小木虫客户端 ]
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天天向上
3楼2014-12-21 00:53:47
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