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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 蛋白不表达，该怎么办？
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向日21

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白不表达，该怎么办？ 已有1人参与

按照正常的顺序，扩增基因，酶切，连接到pet28a里，转化到DH5a中，测序正确，再提取质粒转化到表达菌株中，可是做了几次蛋白都不表达啊，求蛋白表达的高手指导呀！图中最后一个是pet28a，完全是一点特异性都没有！

蛋白不表达，该怎么办？


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1楼 2016-03-08 09:21:25
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)
改变一下诱导条件，温度，加诱导剂时的OD值，诱导时间等等，我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有，那就换载体吧，最简单暴力的办法

你可以看一下那些表达不出来的最后是怎么解决问题的

我之前用的两个载体也是不出，pet22b和pet30a，后来换了pet32a马上出了，诱导条件参数连调都不用调
除了pet32a，还有一个比较好用的就是pgex系列的，学院同学之间要一下吧
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2楼2016-03-08 09:37:19
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nannanz2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
诱导条件可以优化下，另外可以换一下载体，载体很重要
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3楼2016-03-08 11:08:45
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sdjnyxn123 at 2016-03-08 09:37:19
改变一下诱导条件，温度，加诱导剂时的OD值，诱导时间等等，我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有，那就换载体吧，最简单暴力的办法

你可以看一下那些 ...

好的，谢谢，我分析过我的序列，不存在稀有密码子的问题。我用的bl21不表达，又用了rossta ，还是不表达。现在想换一下pet32a。我用的ecor1和Hindiii两个酶切位点，当初做连接就用了三个月，好害怕换载体呀！新手，做实验太难了！

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4楼2016-03-08 11:18:18
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向日21

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sdjnyxn123 at 2016-03-08 09:37:19
改变一下诱导条件，温度，加诱导剂时的OD值，诱导时间等等，我看还有诱导24h之后才表达的···
还有大肠杆菌稀有密码子的问题之类的
如果改变之后依然没有，那就换载体吧，最简单暴力的办法

你可以看一下那些 ...

还有，我的目的片段有2500bp，蛋白有90KD，我一直害怕它不表达

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5楼2016-03-08 11:21:23
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sdjnyxn123

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 向日21 at 2016-03-08 11:21:23
还有，我的目的片段有2500bp，蛋白有90KD，我一直害怕它不表达
...

啊，pet32a融合蛋白本身就挺大的了，好像是有20kD了吧
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6楼2016-03-08 15:09:11
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