透析 蛋白沉淀 复性
我的目的蛋白在用8M尿素溶解后透析复性,透析完后全部沉淀了,跑胶什么都没有!我透析的步骤是:
1、4M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
2、1M尿素 0.1M Tris-Hcl 0.4M L-Arg 1mM EDTA 0.2mM PMSF 5%甘油 PH=8
3、binding buffer 20mM磷酸钠 500mM氯化钠 5mM咪唑 PH=7.6
虫友分析可能是透析蛋白浓度大,梯度变化太大了!于是我重新做了两个对比试验。这次透析的蛋白溶度被我降低了!并且每升只透析20ml,我做了个对比试验:
1号瓶分别用4M 尿素、 1M尿素、binding buffer 透析!
2号瓶分别用4M 尿素、 2M尿素、1M尿素、0M尿素、binding buffer 透析!
结果1号瓶还是在用binding buffer透析是全部出现沉淀,取沉淀跑胶,能看到目的条带!
2号瓶也是在用binding buffer 透析是全部出现沉淀(大约在透析3个小时的时候就有很多沉淀了),和1号瓶一样!另外当2号瓶透析到0M结束时我取了一些样保留下来,跑胶能看到目的条带!
我在想是不是binding buffer 有问题呢?我底下准备用His-tag纯化蛋白,是不是一定要用binding buffer 透析呢? 返回小木虫查看更多
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貌似不可以吧,我的是要除去尿素复性的
,
这么看是binding buffer 的可能性比较大啊。你可以透析到0M urea的时候就不透析了,改为desalting换buffer试试。
具体怎么做呢?
还是换这个buffer,用GE的柱子,就是脱盐柱试试。