应该在酶标板，抗原上找找原因，，能找出方法测试抗原包被的情况吗

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2楼: Originally posted by 北国佳人 at 2015-12-06 10:22:31
应该在酶标板，抗原上找找原因，，能找出方法测试抗原包被的情况吗

我之后在实验过后的板子上继续加入更大浓度的酶标抗体反应1h，后测酶标抗体反应前后的OD值，抗体有减少，而且测酶标孔OD值也有增加，我觉得我包被的抗原确实增加了，但是现在我需要将较低浓度的酶标抗体与包被抗原结合，发现增加包被抗原，酶标抗体到一定程度不减少。

不知道题主设计这个实验的目的是什么？是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量？
看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量，这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原，抗体做梯度稀释，然后OD值进行四参数拟合，理论上在抗体浓度较高时几个点，信号会在平台期，后面会随浓度下降，抗体的信号也会下降，结合60%的点这个时候是能找到的。
抗原要是过量包被的话，定量的抗体都结合上去了，信号当然不会有太大变化。

注意OD值读数一般仪器的检测极限在3.5-4之间，如果信号在这个范围内，信号值可能就不在线性范围了，信号不可信，也就是说信号不能真实反馈结合的强弱了

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4楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-06 21:02:49
不知道题主设计这个实验的目的是什么？是进行抗体的定量还是进行抗原和抗体结合活性的测量？
看样子像是想进行抗原抗体结合活性的测量，这个实验的设计方案应该是包被少量的抗原，抗体做梯度稀释，然后OD值进行四参 ...

非常感谢您的回答，这是我实验的一部分，出了点问题。我现在的问题是要固定量酶标抗体全部被抗原结合，我在找抗原的量（抗体的量是不能变的），所以我设置了不同抗原浓度梯度去和这固定量的抗体反应，但是不管怎么增加抗原量，只能结合这定量抗体的30%，不能够全部结合。请问这是怎么回事？

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5楼: Originally posted by cgkbhf at 2015-12-06 22:03:05
非常感谢您的回答，这是我实验的一部分，出了点问题。我现在的问题是要固定量酶标抗体全部被抗原结合，我在找抗原的量（抗体的量是不能变的），所以我设置了不同抗原浓度梯度去和这固定量的抗体反应，但是不管怎么 ...

固定在酶标板上的是抗体？一般固定在酶标板上的物质，只有10-15%是有活力的，这个见附件。随着抗原的量增加，如果信号到了平台期就说明抗体已经完全结合上了，不知道题主30%是怎么得出来的

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6楼: Originally posted by yyy0305 at 2015-12-06 22:51:02
固定在酶标板上的是抗体？一般固定在酶标板上的物质，只有10-15%是有活力的，这个见附件。随着抗原的量增加，如果信号到了平台期就说明抗体已经完全结合上了，不知道题主30%是怎么得出来的...

可能我表述不太清楚，我的实验步揍是这样的：
1 包被抗原
2 封闭特异性结合位点
3 加入200ul酶标抗体，（加入前已测过OD值）
4 反应后将溶液吸出，测OD值，与加入前的OD做对比，分析酶标抗体被抗原结合多少
5 清洗板孔，加入显色液，终止液，测板孔OD值。验证酶标抗体减少量对应OD值是否与板孔增加OD值一致。
6 增大包被抗原量，仍加入200ul同等浓度的酶标抗体，（目的是将这定量酶标抗体全部被抗原结合）测反应前后酶标抗体的减少。
7 将溶液吸出，清洗板孔，加入200ul 更大浓度酶标抗体，看板孔OD值是否增加。
问题：不断增大包被抗原量，200ul酶标抗体反应后只能被抗原结合30%（通过测反应前后OD值，与标线对比，反应前后酶标抗体浓度减少30%）
但是在加入更大浓度的酶标抗体后，板孔OD值仍在增加，说明仍有未被占据的抗原结合位点，为什么在低浓度的酶标抗体溶液中，该位点不能结合抗体。是达到动态平衡了吗
，

我知道你的实验过程了，但是我还是没弄清楚你的实验目的。有几点可以讨论一下1.拿酶标抗体减少的OD值和显色的OD值比较是没有意义的。具体请查看朗伯比尔定律。他们有不同的吸光系数。2.如果需要抗原全部占据，你包被的抗原必须是少量的，请根据抗原和酶联抗体的摩尔分子量进行计算，而且是远远少量的1:10左右，这样应该有平台期出现，酶联不同加入浓度实验，请同时做，这样好找平台期