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蛋白免疫印迹WB（上）
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western blot 对于任何一个科研菌都不陌生。 but 为甚么别人的实验,时间短跑胶快？ 除了实验精细化操作, 当然也离不开选择最佳的试剂， 和对关键实验步骤的优化设计。 科研就像赛跑，你比别人跑的快，就比别人多发几篇sci~ 蛋白免疫印迹（wb）是基于抗原抗体的特异性结合作用，以检测复杂样品中的某种蛋白，并对其进行半定量分析的一种方法。 主要用于靶标蛋白特异性表达的定性或半定量分析，蛋白与蛋白或蛋白与dna相互作用的后续分析，以及蛋白修饰的鉴定分析。  1.jpg 蛋白样品准备 1.1 蛋白样品来源 用于wb的蛋白样本可以是可溶性蛋白液，细胞\组织裂解液，及免疫沉淀蛋白。对于不同样品蛋白上样量存在区别，纯蛋白建议不超过100 ng，细胞\组织裂解液10-40 μg。 1.2 蛋白样品制备 一般从动植物组织或细胞中提取复杂蛋白成分，在提取过程中应遵守如下原则： ① 结合蛋白特性采用合适的提取方法； ② 采用合适的方法最大限度提取靶标蛋白； ③ 保持低温操作，并加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解； ④ 选择合适的蛋白裂解液，以维持蛋白可溶性状态； ⑤ 蛋白样品-80℃低温保存或变性后保存，避免反复冻融，并尽快检测。 ✪ 细胞样本蛋白制备 ➥待细胞汇合度达到80%，取出培养皿（10 cm），此时细胞生长至对数期，活性良好。弃去培养液，加入预冷的pbs缓冲液洗涤3次，置于冰上。 ➥配制含蛋白酶抑制剂的裂解液，常用蛋白酶抑制剂见下表，需根据实验要求选择合适的蛋白酶抑制剂。最常用的蛋白酶抑制剂为pmsf（工作浓度1 mm），剧毒，使用时应注意自我防护，其在水中半衰期极短，故在临用前加入。 ➥加入1 ml含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液于10 cm培养皿中，轻轻晃匀后，置于冰上裂解15-30 min。 ➥用干净的细胞刮迅速刮取细胞于一侧，并将含细胞碎片的裂解液转移至1.5 mlep管中，置于冰上。此时应避免气泡产生。 注：收集的细胞亦可通过超声破碎进行充分裂解。将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行超声。 ➥于4℃，12000 rpm离心10-15 min。 ➥轻轻取出ep管，用枪头吸去上层上清于新的ep管中，注意不要吸到上层漂浮的脂质等杂质，并置于冰上备用。 ➥经蛋白定量后，加入适量6×sample loading buffer 95℃煮样5 min，12000 rpm离心30 s，-20℃保存。 ✪ 组织样本蛋白制备 ➥获取新鲜组织样本，并用生理盐水或pbs洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。可采用1-2 ml匀浆器置于冰上进行组织匀浆，或加入液氮进行研磨。因组织块相对不易破坏，且在匀浆过程中存在摩擦产热，推荐采用液氮研磨。 ➥配制含蛋白酶抑制剂的裂解液。 ➥加入适量含蛋白酶抑制剂的裂解液（50 mg/500 μl）于研磨后的组织样本中，将离心管置于冰上裂解15-30 min，期间进行间断混匀，以充分裂解。 注：为确保组织细胞充分裂解，建议进行超声破碎。调节超声仪至适宜频率与功率（超声功率不宜过大，并设置超声间歇，以防止超声探头过度产热），将超声探头置于样本裂解液中部，但不触碰管壁或管底，进行冰浴超声。 ➥于4℃，12000 rpm离心10-15 min。 ➥轻轻取出ep管，用枪头吸去上层上清于新的ep管中，注意不要吸到上层漂浮的脂质等杂质，并置于冰上备用。 ➥经蛋白定量后，加入适量的6×sample loading buffer 95℃煮样，12000 rpm离心30 s，-20℃保存。  2.jpg 1.3 蛋白裂解液的选择 蛋白裂解液的主要成分及其作用如下： 1. 缓冲体系 一定ph范围的缓冲体系，为蛋白提供了一个稳定环境，并增加蛋白溶解度。常用近似生理ph状态的tris-hcl或hepes缓冲体系，ph7.4。tris-hcl（pka=8.1）ph缓冲范围为7.0-9.2，其对温度较为敏感。hepes（pka=7.55）ph缓冲范围为6.5-8.5。 2. 盐离子 在适当盐离子浓度下，保持蛋白溶解状态。选择近似生理状态下的150 mm的nacl，不会对破坏蛋白以及蛋白间相互作用产生影响。 3. 螯合剂 螯合金属离子，以防止蛋白提取物过于黏稠，导致溶解度下降。另外，螯合剂亦可与某些酶发生相互作用，以抑制酶活性。 4. 还原剂 加入一定量的还原剂保护蛋白质上自由的巯基不被氧化，从而避免蛋白质的聚集或变性。常用β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（dtt），后者还原能力强于前者。β-巯基乙醇具有挥发性，加入缓冲液中以后较短时间内会被氧化，会对蛋白活性产生影响，其使用浓度为5-20 mm/l。而dtt具有更强的还原能力，且在氧化以后能够形成稳定的分子内二硫键，不会影响蛋白巯基，使用浓度相对偏低为0.5-1 mm/l。长期保存建议使用dtt，但dtt溶液不稳定，需要现配现用。 5. 去垢剂 去垢剂即表面活性剂，其通过分子结构特征，表面活性剂分子的疏水段插入膜的磷脂双分子层，而改变其通透性，最终破坏膜结构。因此，表面活性剂的强度直接决定了裂解细胞的强度。裂解液中所使用的表面活性剂主要可分为两大类：阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂。常用表面活性剂如下： 十二烷基硫酸钠（sds）：阴离子表面活性剂，具有很强的破坏力，基本可以使所有的蛋白溶解，并破坏其天然构象结构。sds与蛋白分子以1.4:1的比例进行结合，可以有效的覆盖蛋白本身所带的电荷情况。sds的临界胶束温度较高，在低温时即会发生沉淀，且在钾盐存在时，沉淀效果会更明显。另外溶液离子强度越强，会降低离子型去污剂的临界胶束浓度，使得这种蛋白溶解效果更强。 脱氧胆酸钠（nadoc）：也是一种离子型表面活性剂，作用较sds弱。 triton x-100：是一种非离子型表面活性剂。可以破坏蛋白质与脂质间的相互作用，但并不使蛋白变性，也不破坏蛋白与蛋白间的连接，能够保留蛋白质的天然构象。其具有较低的临界胶束浓度，在64℃下，可观察到两相分离。 np-40：非离子型表面活性剂，对核膜的破坏作用较弱，与蛋白结合力强，可确保蛋白的充分溶解和结构稳定，特别适用于膜蛋白非变形条件下的溶解。 tween 20：温和非离子型表面活性剂，蛋白溶解能力较弱，也不会破坏蛋白结构，并不作为蛋白裂解液的常见成分。 去污剂的选择取决于所要提取蛋白的性质与实验目的。需要充分裂解细胞，并溶解蛋白，对于提取后蛋白的状态（变性还是保留天然状态）都是需要考虑的问题。 6. 蛋白酶抑制剂 由于在蛋白提取过程中，细胞和组织被破坏，大量蛋白酶被释放。除了保持在低温条件下操作以抑制蛋白酶活性外，还应加入适量蛋白酶抑制剂以抑制蛋白酶的活性，防止目的蛋白的降解。常用蛋白酶抑制剂如下表：  3.jpg 蛋白定量 为了对样品中的目的蛋白进行相对定量，需要对样品间的总蛋白量进行检测。在总蛋白含量一定的情况下，体现目的蛋白的表达差异。常用化学定量方法如下：  4.jpg 最常使用的蛋白定量方法是bca法和bradford法。但当所使用裂解液中含有高浓度去垢剂时，推荐使用bca法定量蛋白。 2.1 bradford法标准曲线的绘制 1.标准蛋白质溶液配制： 10 mg/ml牛血清白蛋白（bsa）标准品。准确称取0.05 g牛血清白蛋白，溶于5 ml pbs中，即为10 mg/ml牛血清白蛋白。 2.考马斯亮蓝g-250染色液配制： 称取50 mg考马斯亮蓝g-250，溶于25 ml 90%乙醇中，加入85%的磷酸50 ml，最后用纯水定容到500 ml，考马斯亮蓝染色液需避光保存。 3.稀释待测蛋白： 将蛋白稀释三种不同梯度的浓度10倍，20倍，40倍。 4.稀释标曲： 将标准品稀释8种不同浓度梯度：  5.png 5.将稀释好的标曲和样品各取20 μl按顺序依次加入到酶标孔条中，然后再依次加入g250染色液180 μl，混匀。 6.在酶标仪595 nm处测定吸光值，根据吸光值做出标准曲线，并根据标准曲线计算蛋白浓度。 2.2 bca检测法 1.根据蛋白数量，按50:1（v/v）的bca试剂a与b配置bca工作液，室温24 h内稳定； 2.溶解标准品，使终浓度为0.5 mg/ml。所用溶剂与样品所用溶剂相同； 3.将标准品按照0，1，2，4，8，12，16，20 μl体积加入到酶标板中，并加标准品稀释液补足到20 μl； 4.向个孔中加入200 μl bca工作液，于37℃放置30 min； 5.酶标仪检测562 nm处吸光度值； 6.根据绘制的标准曲线计算出样品蛋白浓度。 上 样 3.1 蛋白样品制备 变性蛋白，破坏蛋白三级结构，暴露抗原表位，便于抗体结合与后续检测。将定量后的蛋白加入等体积2×sample loading buffer 或1/5体积6×sample loading buffer，于95℃加热煮沸5 min。 对于膜蛋白，由于高温会使得其聚集沉淀，在37℃处理30 min即可。 6×sample loading buffer 配方如下： 6%tris（ph6.8）(v/v) 4%sds（w/v） 0.2%溴汾蓝（w/v） 20%甘油（v/v） 9%dtt（v/v） ● 注意事项： 蛋白溶液上样量以10-40 μg/孔为宜，避免上样量超载，造成拖尾。附：WB实验技术手册 |
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2019-07-10 10:07:53, 364.8 K
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