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目  录
序
  
前言

绪论                                                                    1

一、能用作纯化依据的蛋白质性质                                          1

二、分子相互作用的类型及其影响因素                                      5

三、分离方法的类型                                                      6

参考文献                                                                7

如何使用本指南                                                          9

第1单元 钙调蛋白的纯化 Daniel R. Marshak                                    11

实验1 活性测定：钙调蛋白组分的活性测定                                   19

实验2 组织提取物的制备                                                   24

实验3 粗分级分离                                                         32

实验4 离子交换层析                                                       39

实验5 疏水作用层析                                                       46

实验6 钙调蛋白的鉴定：收率的计算                                         51

实验7 钙调蛋白的鉴定：电泳                                               53

、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳                                      53

二、无法垢剂的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳                                  54

三、尿素梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳与折叠分析                                56

实验8 蛋白质的裂解消化                                                   59

一、钙调蛋白的溴化氰裂解                                                63

二、钙调蛋白的胰蛋白酶消化                                              64

实验9 反相高效液相色谱                                                   66

实验10 钙调蛋白的物理分析                                                70

一、紫外吸收光谱                                                        70

二、蛋白质和肽的质谱                                                    71

实验11 钙调蛋白的化学分析                                                75

一、氨基酸分析                                                          75

二、序列分析                                                            76

试剂的配制                                                              82

第2单元 Hela细胞转录因子AP-1的纯化 James T. Kadonaga                        89

实验1 Hela细胞核提取物的制备                                             91

实验2 Sephacry S-300 HR凝胶过滤层析                                        94

一、如何装填凝胶过滤性                                                  96 二、Hela细胞核提取物的Sephacry S-300 HR柱层析                             98

实验3 序列特异性DNA亲和层析                                             101

一、用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸                                          105

二、DNA亲和介质的制备                                                  107

三、亲和层析中非特异性竞争DNA的正确使用                                112

四、亲和层析的操作                                                      113

实验4 DNA酶I足迹分析                                                    117

一、DNA酶I足迹探针的制备                                               118

二、DNA酶I足迹分析                                                     122

实验5 凝胶迁移变动分析                                                   126

实验6 肝素-Sepharose CL-2B的制备                                           129

试剂的配制                                                              131

参考文献                                                                138

第3单元 大肠杆菌中过表达重组蛋白的纯化 Richard R. Burgess和Mark W. Knuth     141

实验1 大肠杆菌细胞的破碎和包涵体的配制                                   144

实验2 包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析                             148

实验3 可溶性提取物（核心RNA聚合酶-复合物）的聚乙烯亚胺沉淀和免疫亲和层 152
析
一、PEI沉淀法分级分离可溶性提取物                                       153

二、免疫亲和层析                                                        154
实验4 定量测定与制备小结                                                 158

一、蛋白质的定量测定                                                    158

二、定量SDS凝胶染色与扫描                                               159

三、定量蛋白质斑点印迹                                                  160

四、酶测定法                                                            163

五、纯化记录表                                                          164

六、蛋白质纯化总结表与主要组分的总电泳照片                              165

实验5 蛋白质的鉴定                                                       167

一、纯蛋白质的紫外光谱——A280mm/A260nm                                167

二、消光系数的测定（Scopes法）                                           167

三、过载染色SDS凝胶扫描法估测纯度                                       169

四、由非变性凝胶电泳迁移率法评估均一性                                  169

方案补充实验：从过表达细菌提纯                                          172

一、快速蛋白质斑点印迹试验                                              172
二、是可溶的还是不溶的？                                                173

三、溶解包涵体沉淀需多少N-十二烷基肌氨酸钠？                            173

四、沉淀和RNA聚合酶需多少聚乙烯亚胺？                                  174

五、从PEI沉淀洗脱和RNA聚合酶需多少盐？                                 175

六、透析法除N-十二烷基肌氨酸钠需多少时间？                              176  
七、什么透析条件可使可溶的重折叠单体的得率最高？                        177

八、蛋白质与免疫亲和介质结合需多长时间？                                178

九、变性重折叠的其他方法                                                179

十、快速制定细菌过表达产物（无二硫键者）新纯化方案的策略                182

试剂的配制                                                              184

参考文献                                                                189

第4单元 鼠肝胰岛素受体的溶解与纯化 William A. Brennan.Jr和Sue-Hwa Lin         193

实验1 大鼠肝脏质膜的分离                                                 195

一、分离肝脏质膜的Neville法                                               197

二、从组织分离粗制质膜组分的另一方法                                    198

三、存在干扰物质条件下的蛋白质浓度测定                                  199

四、膜上胰岛素受体数量的测定                                            
201


五、胰岛素受体对胰岛素亲和性的测定                                      202

实验2 膜胰岛素受体的溶解                                                 205

一、胰岛素受体的溶解及活性测定                                          211

二、溶解膜蛋白用的去垢剂的筛选                                          213

实验3 溶解受体的凝集素亲和层析                                           215

实验4 部分纯化受体的胰岛素亲和层析                                       219

一、胰岛素亲和层析                                                      220

二、配体与活化介质的偶联                                                221

实验5 胰岛素受体与胰岛素的交联                                           223

实验6 胰岛素激素的胰岛素受体自磷酸化                                     226

实验7 胰岛素受体糖基化的分析                                             229

试剂的配制                                                              234

参考文献                                                                240

附录                                                                    243

附录1 pH的测量                                                          243

附录2 缓冲液的配制                                                       245

附录3 电导率的测量                                                       247
附录4 固态硫酸铵法分级分离                                               248

附录5 蛋白质的SDS-PAGE电泳                                              249

一、电泳                                                                251

二、凝胶染色                                                            256

三、样品制备（沉淀法）                                                  259

附录6 蛋白质的过甲酸氧化                                                 263

附录7 用亚氨基二乙酸Sepharose 6B分离磷酸肽                                 265

附录8 蛋白质内序分析用肽段的分离与纯化                                   267
附录9 推荐读物                                                           269

技术索引                                                                271

主题索引                                                                273[ 来自科研家族 Natural Products家族 ]

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