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请教PCR体系问题

以前做过PCR,但都是师兄师姐给的一个体系,就是dNTP加多少,Taq酶加多少,模板加多少,引物加多少等的,加多少量都给弄好了,但是做了几个不同的基因的PCR后,每次加的量有时是一样的,像有次可能是Taq酶加1.5μL,但是下次可能就是1μL了。这个体系是怎么来的啊,就是加多少的量,很迷茫:(。
请明白的虫友给讲讲,谢谢了

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用户评论

你去天根或者全式金的网站上随便找个taq酶的说明书看看就明白了,加多少并不重要,关键是按比例加,但是这个比例也不是固定的,你要明白所有的Protocol都不是一成不变的,都是可以修改的,

根据你所用的Taq酶来决定,可以参考Taq酶的说明书。但是一般说明书上所用的Taq酶的量都比较大,你可以将酶的量减半,其他试剂的量按照说明书即可。
另外,常用的PCR体系一般为20ul和50ul,根据需要而定。

我做的时候是根据标准体系然后根据PCR结果有针对性的慢慢做改变,一直到扩增产物达到预期标准。
模板:10^4 -- 10^6 copies
引物:0.1-0.5pM/each
Mg离子:1-3mM
dNTP:200uM/each
Taq酶:1-4U/100uL
总体系为100uL。
更具体的可以参阅一些文献和书籍,wikipedia之类的啊。

学习了:(:(:(

现在有卖种已经预混合好的体系,你只需加1u的引物和模板就行了。我做了好多,跑电泳时的效果就是比一样一样加的好。可以试下。

谢谢各位虫友,学习了好多自己以前不知道的:)
十分感谢!

引物,dNTP,酶的量也要看循环数和扩增片段的长度适当调整

其实每种成分并不是一定的,只要在一定的范围内就行了,但最好是最佳浓度

酶按照它的说明书加多少u就行了,量大了里面的甘油反而会影响酶活.
dNTP过高则不能扩增,过低将降低反应产物的产量.浓度一般为50-400 uM
镁离子过高,使反就特异性降低,过低则产物减少.当dNTP为200 uM时,镁一般为1.5mM较合适.
引物过高,会形成较多的引物二聚体,过少则产物减少
另外,退火温度也要注意,在Tm值允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非持异性结合,提高PCR的特异性.

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