以前做过PCR,但都是师兄师姐给的一个体系,就是dNTP加多少,Taq酶加多少,模板加多少,引物加多少等的,加多少量都给弄好了,但是做了几个不同的基因的PCR后,每次加的量有时是一样的,像有次可能是Taq酶加1.5μL,但是下次可能就是1μL了。这个体系是怎么来的啊,就是加多少的量,很迷茫。 请明白的虫友给讲讲,谢谢了 返回小木虫查看更多
引物,dNTP,酶的量也要看循环数和扩增片段的长度适当调整
其实每种成分并不是一定的,只要在一定的范围内就行了,但最好是最佳浓度
酶按照它的说明书加多少u就行了,量大了里面的甘油反而会影响酶活. dNTP过高则不能扩增,过低将降低反应产物的产量.浓度一般为50-400 uM 镁离子过高,使反就特异性降低,过低则产物减少.当dNTP为200 uM时,镁一般为1.5mM较合适. 引物过高,会形成较多的引物二聚体,过少则产物减少 另外,退火温度也要注意,在Tm值允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非持异性结合,提高PCR的特异性,
引物,dNTP,酶的量也要看循环数和扩增片段的长度适当调整
其实每种成分并不是一定的,只要在一定的范围内就行了,但最好是最佳浓度
酶按照它的说明书加多少u就行了,量大了里面的甘油反而会影响酶活.
dNTP过高则不能扩增,过低将降低反应产物的产量.浓度一般为50-400 uM
镁离子过高,使反就特异性降低,过低则产物减少.当dNTP为200 uM时,镁一般为1.5mM较合适.
引物过高,会形成较多的引物二聚体,过少则产物减少
另外,退火温度也要注意,在Tm值允许的范围内,选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非持异性结合,提高PCR的特异性,