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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR凝胶电泳图求助
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喝茶的面包

银虫 (初入文坛)

[求助] PCR凝胶电泳图求助 已有2人参与

自己设计的引物，PCR过后凝胶电泳，拍出来的图如附件，最右边没有加DNA模板，用DEPC处理水代替的，请问跑出来的条带是非特异性扩展的产物吗？

PCR凝胶电泳图求助
PCR.jpg
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1楼 2016-01-15 13:51:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

奇怪人生123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-01-15 22:30:56
看了你的电泳图，听了你的描述，有疑问：1.你说用DEPC水作为模板的阴性对照，位置具体是哪一电泳道？最后在电泳图上标明。（直说最右边真不清楚你说的是哪一个）2.你的目的条带是多大的？
看电泳图，中间有一条比较亮的条带，似乎是你的目的条带。同时，也有许多杂带（非特异性条带），怀疑与PCR时退火温度的选择有关。
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实时荧光定量PCR（TaqMan探针法）欢迎和大家探讨~
2楼2016-01-15 16:20:46
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普通回帖

大海一孤舟

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-01-15 22:31:10
连水都有条带，要不就是水污染了模板，要不就是实验出现了错误；
如果排除以上的可能性，那就是引物自身的扩增，可以考虑更换引物。
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3楼2016-01-15 16:21:08
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喝茶的面包

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 奇怪人生123 at 2016-01-15 16:20:46
看了你的电泳图，听了你的描述，有疑问：1.你说用DEPC水作为模板的阴性对照，位置具体是哪一电泳道？最后在电泳图上标明。（直说最右边真不清楚你说的是哪一个）2.你的目的条带是多大的？
看电泳图，中间有一条比较 ...

你好，DEPC水作为模板的阴性对照是在泳道5，采用MarkⅡ作为参照，目的产物的大小根据基因库里下载的序列算出来理论值为198bp（是否准确还有待验证），退火温度为65℃。请问，中间的条带不是引物二聚体吧？
PCR凝胶电泳图求助-1
PCR.jpg
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4楼2016-01-15 19:34:02
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喝茶的面包

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 大海一孤舟 at 2016-01-15 16:21:08
连水都有条带，要不就是水污染了模板，要不就是实验出现了错误；
如果排除以上的可能性，那就是引物自身的扩增，可以考虑更换引物。

引物是自己设计的简并引物，更换引物的话，需要花费很多精力，所以需要确定具体哪里出问题了，DEPC处理水，我再做次实验验证一下。
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5楼2016-01-15 19:36:17
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奇怪人生123

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你中间较亮的条带肯定不是引物二聚体，引物二聚体大小很小，电泳后100 bp都不一定能达到。而且，引物二聚体也不是这个样子的。
如果确定没有在阴性对照误加入模板，我就很怀疑是否你的水或者试剂有DNA污染。首先确定水是需要是无菌水（最好用刚灭过菌或新拆封的），接下来需要排除引物和酶是否有污染。
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实时荧光定量PCR（TaqMan探针法）欢迎和大家探讨~
6楼2016-01-17 22:14:53
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997821428

铜虫 (小有名气)
请问一下，你们这些照片是用凝胶成像仪拍出来？我的就拍不出来这种效果

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姐不约，咱不约。啥？为啥？姐爱妹子
7楼2016-02-18 23:08:00
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8023xz

铁杆木虫 (文坛精英)
除了上述这些，看看pcr管是不是有问题

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8楼2016-02-18 23:13:17
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匿名

用户注销 (正式写手)
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9楼2016-02-19 00:30:36
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喝茶的面包

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 997821428 at 2016-02-18 23:08:00
请问一下，你们这些照片是用凝胶成像仪拍出来？我的就拍不出来这种效果

是采用凝胶成像仪拍出来的图，除了mark效果还行以外，pcr产物进行凝胶电泳后拍照效果不是很理想，具体原因还在查找。您指的拍不出这种效果具体是什么呢？
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10楼2016-03-02 15:34:18
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