| 查看: 6634 | 回复: 18 | ||
吗子金虫 (小有名气)
|
[求助]
重组质粒一直连接不上，求助。。。。 已有7人参与
|
|
|
我最近构建一个质粒，将目的基因片段（250bp）,连接到表达载体上（1 5000 bp）。但是连接后涂扳一直没上出想要的菌落来。方法如下： 先将目的基因连接于T载体，然后同时用kpn 1 和 sac 1 双酶切 T载体 和表达载体，并凝胶电泳回收目的片段及双酶切后的表达载体，然后进行重组连接。 连接用的TAKARA T4酶 10ul体系。1ul 酶，1ul buffer,其余加载体和片段，试了很多比例（载体：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都没有成功），连接16℃过夜12-14h。 涂扳后16小时内基本不长什么菌落，或者长的话也很小根本不好挑，长大了挑做PCR要么阴性要么假阳性。做了快2个月了，一直不知道问题出在哪啊，都要崩溃了。特在此求助各位虫友啦。谢谢啦 附上我胶回收的2张图片，请大家帮忙分析一下啊，不胜感激。   左边为双酶切的表达载体质粒，右边是目的片段.jpg  胶回收后的电泳.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有194人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- sacB负筛选遇到的问题？
已经有2人回复
- 做质粒重组的虫友们请看这
已经有41人回复
- 原核表达始终构建载体不成功！！！！
已经有18人回复
- 关于构建pET28a载体转化后IPTG诱导跑SDS-PAGE胶问题。
已经有25人回复
- 求助！双酶切验证总切出来四条带，请亲们帮忙看看，非常着急啊！谢谢大家了！
已经有32人回复
- 双抗平板中长出了菌落，不知道是不是自己所要的重组菌
已经有5人回复
- 基因敲除问题请教，都是假阳性，根本筛不到突变株
已经有1人回复
- 2012年我国农业生产转变方式研究分析
已经有1人回复
- （侯氏出品）双酶切连接反应之全攻略
已经有89人回复
- 重组质粒出现问题
已经有9人回复
- 蓝白斑筛选
已经有2人回复
- 关于酵母表达
已经有4人回复
- 重组质粒
已经有2人回复
- 求助连接反应中的问题，谢谢!
已经有7人回复
- 【求助/交流】菌液PCR的经验
已经有6人回复
- 【求助/交流】质粒提取不出来--郁闷
已经有24人回复
吗子
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1200.9
- 散金: 49
- 红花: 13
- 帖子: 149
- 在线: 79.1小时
- 虫号: 2222309
- 注册: 2013-01-04
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
3楼2015-08-26 12:17:08
evangelina
无虫 (小有名气)
- 应助: 72 (初中生)
- 金币: -31.9
- 红花: 3
- 帖子: 135
- 在线: 58.4小时
- 虫号: 3180737
- 注册: 2014-05-05
- 性别: GG
- 专业: 病毒学
2楼2015-08-26 11:35:01
huangxun2000
新虫 (初入文坛)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 27
- 散金: 9
- 帖子: 44
- 在线: 108.3小时
- 虫号: 1323033
- 注册: 2011-06-14
- 专业: 制造系统与自动化
4楼2015-08-26 20:31:41
吗子
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1200.9
- 散金: 49
- 红花: 13
- 帖子: 149
- 在线: 79.1小时
- 虫号: 2222309
- 注册: 2013-01-04
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
5楼2015-08-27 19:36:44
6楼2015-09-11 09:58:42
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
吗子: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我现在连接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受态转化，16℃过夜；载体双酶切后跑电泳回收的，跑的时候还作了2个单酶切的对照和1个没有切的质粒，然后2个单酶切都切开了，双切的条带也和单切的一样变长了。转化应该是没有问题。换了酶实验还是没连上，我觉得应该是载体那出了问题。 2015-09-11 10:57:06
吗子: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我现在连接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受态转化，16℃过夜；载体双酶切后跑电泳回收的，跑的时候还作了2个单酶切的对照和1个没有切的质粒，然后2个单酶切都切开了，双切的条带也和单切的一样变长了。转化应该是没有问题。换了酶实验还是没连上，我觉得应该是载体那出了问题。 2015-09-11 10:57:06
|
我建议你先将连接产物跑电泳，看看有没有连上。 如果连上了说明是转化的问题。一般50ul的感受态细胞加入2~5ul的连接产物，这样不会改变感受态细胞的生存环境，如果连接产物用多了的话也有可能不长菌落。 如果没有连接上的话，很可能是因为你的15000bp载体并没有切干净，所以连接效果不好。建议你重新酶切 |
7楼2015-09-11 10:30:06
吗子
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1200.9
- 散金: 49
- 红花: 13
- 帖子: 149
- 在线: 79.1小时
- 虫号: 2222309
- 注册: 2013-01-04
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
8楼2015-09-11 10:59:23
吗子
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1200.9
- 散金: 49
- 红花: 13
- 帖子: 149
- 在线: 79.1小时
- 虫号: 2222309
- 注册: 2013-01-04
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
9楼2015-09-11 11:21:43
吗子
金虫 (小有名气)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 1200.9
- 散金: 49
- 红花: 13
- 帖子: 149
- 在线: 79.1小时
- 虫号: 2222309
- 注册: 2013-01-04
- 性别: GG
- 专业: 农业昆虫学
10楼2015-09-11 11:22:56
50