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吗子管理员
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重组质粒一直连接不上，求助。。。。 已有7人参与
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我最近构建一个质粒，将目的基因片段（250bp）,连接到表达载体上（1 5000 bp）。但是连接后涂扳一直没上出想要的菌落来。方法如下： 先将目的基因连接于T载体，然后同时用kpn 1 和 sac 1 双酶切 T载体 和表达载体，并凝胶电泳回收目的片段及双酶切后的表达载体，然后进行重组连接。 连接用的TAKARA T4酶 10ul体系。1ul 酶，1ul buffer,其余加载体和片段，试了很多比例（载体：片段=1:1,3:1,10:1,20:1 1:10 都没有成功），连接16℃过夜12-14h。 涂扳后16小时内基本不长什么菌落，或者长的话也很小根本不好挑，长大了挑做PCR要么阴性要么假阳性。做了快2个月了，一直不知道问题出在哪啊，都要崩溃了。特在此求助各位虫友啦。谢谢啦 附上我胶回收的2张图片，请大家帮忙分析一下啊，不胜感激。   左边为双酶切的表达载体质粒，右边是目的片段.jpg  胶回收后的电泳.jpg |
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吗子
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3楼2015-08-26 12:17:08
evangelina
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
吗子: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我现在连接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受态转化，16℃过夜；载体双酶切后跑电泳回收的，跑的时候还作了2个单酶切的对照和1个没有切的质粒，然后2个单酶切都切开了，双切的条带也和单切的一样变长了。转化应该是没有问题。换了酶实验还是没连上，我觉得应该是载体那出了问题。 2015-09-11 10:57:06
吗子: 金币+5, ★有帮助, 谢谢，我现在连接10ul，然后是把10ul，加入50ul感受态转化，16℃过夜；载体双酶切后跑电泳回收的，跑的时候还作了2个单酶切的对照和1个没有切的质粒，然后2个单酶切都切开了，双切的条带也和单切的一样变长了。转化应该是没有问题。换了酶实验还是没连上，我觉得应该是载体那出了问题。 2015-09-11 10:57:06
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我建议你先将连接产物跑电泳，看看有没有连上。 如果连上了说明是转化的问题。一般50ul的感受态细胞加入2~5ul的连接产物，这样不会改变感受态细胞的生存环境，如果连接产物用多了的话也有可能不长菌落。 如果没有连接上的话，很可能是因为你的15000bp载体并没有切干净，所以连接效果不好。建议你重新酶切 |
7楼2015-09-11 10:30:06
吗子
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8楼2015-09-11 10:59:23
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