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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒一直连接不上，求助。。。。
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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们一直用mbi的酶。看起来按u算比nebtakara贵好多

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11楼2015-09-11 13:13:40
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yigeerliu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-11 11:22:56
我换了NEB的T4酶，结果还是和以前一样，没有连接上呢。你的是什么情况？可以说出来大家一起讨论哈...

我第一次做的时候，只长了一个菌，然后酶切、PCR都对，去测序，目的蛋白也没问题，但是后来发现载体突变， 所以失败。
第二次长了很多很多，但是都是假阳性的。所以失败。
第三次一个也没长。
今天在做一批试试。。。。。。只能是试试
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12楼2015-09-11 14:07:07
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吗子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 酒家何处 at 2015-09-11 13:13:40
我们一直用mbi的酶。看起来按u算比nebtakara贵好多

你们做连接的时候是怎么算U值，然后确定加多少样连的？我老师让我重新算好再确定比例连接。
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深秋
13楼2015-09-11 14:57:16
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吗子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by yigeerliu at 2015-09-11 14:07:07
我第一次做的时候，只长了一个菌，然后酶切、PCR都对，去测序，目的蛋白也没问题，但是后来发现载体突变， 所以失败。
第二次长了很多很多，但是都是假阳性的。所以失败。
第三次一个也没长。
今天在做一批试试 ...

你连接体系和比例怎么样，我是16℃过夜连的。
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深秋
14楼2015-09-11 14:58:39
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Cruiser肖

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

同学，我遇到了跟你完全一样的情况，也是两个月了，两个段缺失居然没有构出来，确实醉了
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15楼2015-09-11 16:37:22
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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-11 14:57:16
你们做连接的时候是怎么算U值，然后确定加多少样连的？我老师让我重新算好再确定比例连接。...

我们一般10ul体系加1ul，mbi的t4，5u/ul。摩尔比3:1。buffer用自带buffer和自带peg4000作连接液。都算做10倍，都加1ul

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16楼2015-09-11 23:32:30
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

载体的问题，酶切没有切好！首先保证你的载体没有被酶切操作过的原始质粒。然后是分别用两个酶单独切载体，观察电泳条带变化，判断两个酶是否都能切开。再用另外一个酶切后，连接……
总之是保证酶切没有问题，定能成功……

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17楼2015-09-12 08:39:53
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吗子

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by Cruiser肖 at 2015-09-11 16:37:22
同学，我遇到了跟你完全一样的情况，也是两个月了，两个段缺失居然没有构出来，确实醉了

现在，怎么样了
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深秋
18楼2015-09-16 16:03:23
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个连接不上确实是很头疼的问题，我有被折腾近4个月。最后用IN-FUSION克隆技术，很快就好了，推荐也尝试一下，这个方法很快
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19楼2015-09-19 11:34:10
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