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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们一直用mbi的酶。看起来按u算比nebtakara贵好多

发自小木虫Android客户端
11楼2015-09-11 13:13:40
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yigeerliu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-11 11:22:56
我换了NEB的T4酶,结果还是和以前一样,没有连接上呢。你的是什么情况?可以说出来大家一起讨论哈...

我第一次做的时候,只长了一个菌,然后酶切、PCR都对,去测序,目的蛋白也没问题,但是后来发现载体突变, 所以失败。
第二次长了很多很多,但是都是假阳性的。所以失败。
第三次一个也没长。
今天在做一批试试。。。。。。只能是试试
12楼2015-09-11 14:07:07
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吗子

金虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 酒家何处 at 2015-09-11 13:13:40
我们一直用mbi的酶。看起来按u算比nebtakara贵好多

你们做连接的时候是怎么算U值,然后确定加多少样连的?我老师让我重新算好再确定比例连接。
深秋
13楼2015-09-11 14:57:16
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吗子

金虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by yigeerliu at 2015-09-11 14:07:07
我第一次做的时候,只长了一个菌,然后酶切、PCR都对,去测序,目的蛋白也没问题,但是后来发现载体突变, 所以失败。
第二次长了很多很多,但是都是假阳性的。所以失败。
第三次一个也没长。
今天在做一批试试 ...

你连接体系和比例怎么样,我是16℃过夜连的。
深秋
14楼2015-09-11 14:58:39
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Cruiser肖

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

同学,我遇到了跟你完全一样的情况,也是两个月了,两个段缺失居然没有构出来,确实醉了
15楼2015-09-11 16:37:22
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酒家何处

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-11 14:57:16
你们做连接的时候是怎么算U值,然后确定加多少样连的?我老师让我重新算好再确定比例连接。...

我们一般10ul体系加1ul,mbi的t4,5u/ul。摩尔比3:1。buffer用自带buffer和自带peg4000作连接液。都算做10倍,都加1ul

发自小木虫Android客户端
16楼2015-09-11 23:32:30
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renzhiq

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

载体的问题,酶切没有切好!首先保证你的载体没有被酶切操作过的原始质粒。然后是分别用两个酶单独切载体,观察电泳条带变化,判断两个酶是否都能切开。再用另外一个酶切后,连接……
总之是保证酶切没有问题,定能成功……

发自小木虫Android客户端
17楼2015-09-12 08:39:53
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吗子

金虫 (小有名气)

引用回帖:
15楼: Originally posted by Cruiser肖 at 2015-09-11 16:37:22
同学,我遇到了跟你完全一样的情况,也是两个月了,两个段缺失居然没有构出来,确实醉了

现在,怎么样了
深秋
18楼2015-09-16 16:03:23
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

这个连接不上确实是很头疼的问题,我有被折腾近4个月。最后用IN-FUSION克隆技术,很快就好了,推荐也尝试一下,这个方法很快
19楼2015-09-19 11:34:10
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